|
ОБРАТИТЕ ВНИМАНИЕ!!!
Заметки по редактированию:
Слова альфа, бета заменить соответствующими буквами греческого алфавита.
-- заменить на тире,
ampersand -- на соответствующий символ.
I. Запуск докинга через графическую оболочку -- AutoDock Tools (ADT)
1. Разделение лиганд-рецепторного комплекса
Как правило, молекула белка в pdb-файле находится в комплексе с молекулами растворителя, а также молекулой ингибитора или активатора. Программа AutoDock не учитывает взаимодействие молекул растворителя с другими молекулами, поэтому их необходимо удалять.
Также для успешного докинга необходимо очищать связывающий сайт белка от находящихся в нем молекул (как правило, это молекула активатора или ингибитора).
Закачка и загрузка в ADT pdb-файла
1) Откройте браузер, перейдите по адресу www.rcsb.org, наберите в поисковой строке имя искомой молекулы, нажмите кнопку Find.
а) Запустите ADT через ярлык на рабочем столе.
б) Откройте pdb-файл, содержащий молекулу белка в комплексе с молекулами растворителя и другими молекулами: File --> Read Molecule --> vs_xxxx --> xxxx.pdb --> Открыть
Работа с просмоторщиком
[Табличка с описанием, какая кнопка какую команду выполняет]
Различные схемы отображения молекул и цветовые схемы
По умолчанию молекулы отображаются как совокупность связей между атомами: связи показаны как стрежни, атомы -- точки соединения этих стержней.
1) Изучите иерархический список молекул, полимерных цепей (аминокислотных цепей в случае белка), химических группировок (аминокислотных остатков в случае белка) и атомов, находящийся в нижней части окна ADT.
В этом списке в данный момент одна молекула -- xxxx, содержащая одну или несколько субъединиц -- аминокислотных цепей (Chain). Щелкните по треугольнику слева от имени молекулы xxxx, чтобы увидеть список субъединиц. Субъединицы, как правило, носят имена A, B, C и т. д. Если вы щелкните на треугольнике слева от имени какой-либо цепи, вашему взору откроется список аминокислот, составляющих эту цепь. Каждая аминокислота состоит из нескольких атомов (щелкните по треугольнику, если хотите убедиться).
2) Справа от каждого элемента списка расположен ряд кружков и квадратов.
3) Щелкните по кружку, расположенному на пересечении строки с именем молекулы xxxx и столбца Rib. (Ribbon переводится как лента). Щелкните по кружку на пересечении строки с именем молекулы xxxx и столбца Lines. Стержневое отображение молекулы будет снято, будет показана только вторичная структура. Для большей наглядности щелкните по квадрату на пересечении строки с именем молекулы xxxx и столбца Sec. Str. (Secondary Structure -- вторичная структура). Альфа-спирали отображаются как красные спирали, бета-складки -- как желтые полосы, фрагменты аминокислотной последовательности, не относящиеся ни к альфа-спиралям, ни к бета-складкам -- как серые или синие петли.
Повращайте молекулу, нажав и удерживая среднюю кнопку мыши. Приблизьте ее фрагменты, которые хотели бы рассмотреть, вращением колесика мыши.
Уберите отображение вторичной структуры, щелкнув по соответствующему кружку.
4) Щелкните по кружку на пересечении строки с именем молекулы и столбца SampersandB. Будет включено шарико-стержневое отображение молекулы (Sticks and balls -- стержни и шары). Раскрасьте всю молекулу по типам атомов (столбец Atom). Окрасьте каждую субъединицу белковой молекулы в свой цвет (квадрат на пересечении строки с именем молекулы xxxx и столбца Chain).
Уберите шарико-стержневое отображение молекулы.
5) Щелкните по кружку на пересечении строки с именем молекулы и столбца MS. Будет показана поверхность молекулы. Поочередно щелкните по квадратам в столбцах Atom, Chain, RAS и SHA. RAS и SHA -- цветовые схемы, в которых каждая аминокислота показана своим цветом.
Очистка молекулы рецептора.
3) Select --> Select From String
4) В текстовом поле Residue напечатайте HOH*, в текстовом поле Atom -- *. Будут выделены все молекулы воды, находящиеся в этом pdb-файле. Знак * служит заменой любого количества любых символов.
5) Edit --> Delete --> Delete AtomSet. Будут удалены все выделенные молекулы, в данном случае -- молекулы воды.
6) Найдите в иерархическом списке в нижней части окна AutoDockTools имена, отличающиеся от регулярно повторяющихся имен аминокислотных остатков. Этому имени должно соответствовать одно из веществ, перечисленных на странице pdb-файла на сайте базы данных RCSB PDB в разделе . Скорее всего, это ингибитор или активатор, находящийся в лиганд-связывающем центре белка.
7) Select --> Select From String
8) В текстовом поле Residue через запятую напечатайте (перечислите) имена веществ, расположенных в лиганд-связывающем центре белка, в текстовом поле Atom -- *.
9) Edit --> Delete --> Delete AtomSet.
10) File --> Save --> Write PDB
11) В текстовом поле Filename напечатайте [путь]/xxxx_rec.pdb
12) Отметьте флажок Sort Nodes, нажмите кнопку OK
2.2. Подготовка файла рецептора
Современные способы получения данных о пространственном строении молекул (рентгеноструктурная кристаллография, ядерно-магнитный резонанс) не позволяют точно установить координаты всех атомов водорода. Для дальнейшей работы, в том числе для постановки докинга, модель молекулы белка должна содержать все атомы, присутствующие в реальной молекуле. Пакет программ ADT позволяет это сделать.
1) Заново откройте молекулу рецептора:
Щелкните правой кнопкой мыши на имени молекулы в нижней части окна ADT. Левой щелкните на delete.
File --> Read Molecule --> xxxx_rec.pdb --> Открыть
2) Edit --> Hydrogens --> Add. К молекуле белка будут добавлены недостающие атомы водорода.
3) Edit --> Charges --> Compute Gasteiger. Будет вычислен частичный заряд Гастайгера для каждого атома.
4) Edit --> Hydroges --> Merge non-polar
5) Edit --> Atoms --> Assign AD4 type. Каждому атому будет присвоен один из следующих типов:
C -- алифатический атом углерода
A -- ароматический атом углерода
N -- атом азота
O -- атом кислорода
S -- атом серы
H -- атом водорода
6) Сохраните результат как pdbqt-файл (q -- электрический заряд, t -- тип атома):
File --> Save --> Write PDBQT
Отметьте флажок Sort Nodes, нажмите кнопку OK
7) Удалите молекулу рецептора. Для этого щелкните правой кнопкой мыши по имени молекулы в списке в нижней части окна AutoDockTools, нажмите delete.
2.3. Подготовка файла лиганда
1) Ligand --> Input --> Open
2) Смените Тип файлов с PDBQT на PDB.
3) Выберите ..., нажмите кнопку Открыть.
4) Ligand --> Torsion Tree --> Detect Root...
Будет выбран "корневой" атом -- атом, соединенный с другими атомами наибольшим количеством невращаемых связей; вокруг атомов, с которыми соединен "корневой", тоже должно быть много невращаемых связей. Совокупность атомов, соединенных невращаеыми связями, называют корнем.
5) Посмотрите, какие атомы входят в корень:
Ligand --> Torsion Tree --> Show Root Expansion
6) Посмотрите, какие связи невращаемы:
Ligand --> Torsion Tree --> Choose Torsions...
В этом диалоговом окне можно указать, какие связи и какие типы связей будут вращаемыми (из числа тех, которые в принципе могут вращаться).
Для того, чтобы выделить атомы, щелкните по ним или выделите их рамкой. Выделенные (выбранные) атомы будут помечены желтыми крестами. Нажмите кнопку Make bonds between selected atoms non-rotatable, чтобы сделать связи между выделенными (выбранными) атомами вращаемыми. Вращаемые (rotatable) связи обозначаются зеленым цветом; те, которые не вращаются, но которые можно сделать вращаемыми (non-rotatable) -- сиреневым; связи, которые нельзя сделать вращаемыми (unrotatable) -- красным.
Также можно сделать невращаемыми все связи в пептидном остове молекулы (кнопка Make peptide backbone bonds non-rotatable), сделать вращаемыми все амидные связи (кнопка Make amide bonds rotatable), сделать вращаемыми все гуанидиновые связи (кнопка Make guanidinium bonds rotatable), сделать все вращаемые связи невращаемыми или, наоборот, сделать все невращаемые связи вращаемыми (кнопка Make all rotatable bonds non-rotatable/Make all rotatable bonds rotatable).
Как выбрать, какие связи будут вращаемыми, а какие -- нет? Это должен решать человек, ставящий докинг, в зависимости от того, какая часть критически важна для активации рецептора и т. п. Как правило, подвижными стоит делать аминокислотные остатки, расположенные в связывающем сайте белковой молекулы.
AutoDock 4.0 позволяет рассчитывать взаимодействие молекул (лиганда и рецептора), в которых в сумме не более 32 подвижных (вращаемых) связей. Об этом напоминает надпись Number of rotatable bonds = n/32 в диалоговом окне Torsion Count, где n -- число вращаемых связей на данный момент, 32 -- максимально допустимое число вращаемых связей.
Сейчас сделайте так, чтобы число вращаемых связей в молекуле было не более 8.
Нажмите кнопку Done, чтобы закрыть диалоговое окно Torsion Count.
7) Ligand --> Torsion Tree --> Hide Root Expansion
8) Ligand --> Torsion Tree --> Show/Hide Root Marker
9) Ligand --> Output --> Save as PDBQT... Сохраните лиганд под старым или же под новым именем.
10) Удалите молекулу лиганда. Для этого щелкните правой кнопкой мыши по имени молекулы в списке в нижней части окна AutoDockTools, нажмите delete.
3. Построение сетки
3.1. Подготовка gpf-файла
В файле с параметрами сетки (grid parameter file, gpf-file) содержится информация о том, для какого рецептора вычислять энергетические потенциалы для каждого атома, энергетические карты для каких атомов строить и размеры этих карт.
1) Grid --> Macromolecule --> Open...
Указать, для какой молекулы белка создать gpf-файл.
2) Grid --> Set Map types --> Open ligand...
Указать, типы атомов из какого лиганда будут использованы для создания gpf-файла.
3) Grid --> Grid box...
Меню с параметрами создаваемой сетки.
4) Center --> Center on ligand
Сцентрировать сетку по центру лиганда (совместить центр сетки с центром лиганда).
5) Повращайте цветные колесики, расположенные в верхней половине окна, чтобы изменить размеры сетки. Число, написанное на каждом колесике, обозначает число точек в сетке по данной оси: по оси x -- число на красном колесике, по оси y -- на зеленом и по оси z -- на синем. Размер сетки должен быть таким, чтобы лиганд не выходил за ее пределы при любых положениях и при любом вращении любых связей лигандв вокруг своей оси.
Серое колесико регулирует расстояние между двумя ближайшими точками по одной оси (задается в ангстремах). Оставьте это расстояние равным 0.375.
6) File --> Close saving current
Закрыть окно Grid Options, сохранив параметры сетки.
7) Output --> Save GPF...
Сохранить параметры сетки в gpf-файле.
3.2. Построение энергетических карт при помощи модуля AutoGrid, входящего в ADT
Запуск AutoGrid .
-- Необходимо поместить файл AutoGrid в рабочую папку (в рабочей папке необходимо поместить все файлы подготовленного лиганда, рецептора)
-- Находясь в рабочей папке, запустите терминал с помощью правой кнопки мыши. В открытом окне терминала необходимо написать командную строку /. AutoGrid4 –p ./имя файла.gpf –l ./имя файла.gpf и сделать эту команду исполняемой (Enter). После в окне терминала вы увидите либо сообщение об ошибке, либо сообщение о успешном завершении работы ./ AutoGrid4: Successful Completion on localhost.
3.3.Подготовка файла с параметрами докинга.
-- Docking -> Macromolecule -> Set Rigid Filename это позволяет выбрать молекулу рецептора с расширением *.pdbqt
-- Ligand -> Open выбираем молекулу лиганда с расширением *.pdbqt
--Search Parameters -> Genetic Algoritm...
• Для пробного докинга который позволит установить есть ли связь и силу этой связи:
Необходимо изменить некоторые параметры :
***Namber of GA Runs в это поле поставьте 2 –это кол-во шагов
***Population size : 150
***Max Number of evels: уменьшите данный показатель до 25000
• Для точных и более достоверных расчетов:
***Namber of GA Runs в это поле поставьте 10-50
***Max Number of evels: данный показатель 2500000-25000000
--Output-> Lamarckin GA... Сохраните данный файл в рабочей папке
3.4. Докинг
-- -- Необходимо поместить файл AutoDock в рабочую папку, где находится файл AutoGrid4
-- Находясь в рабочей папке, запустите терминал с помощью правой кнопки мыши. В открытом окне терминала необходимо написать командную строку /. AutoDock4 –p ./имя файла.gpf –l ./имя файла.dlg и сделать эту команду исполняемой (Enter). После в окне терминала вы увидите либо сообщение об ошибке, либо сообщение о успешном завершении работы ./ AutoDock4: Successful Completion on localhost.
3.5.
Докинг завершен. Теперь необходимо только интерпретировать результаты. Сам докинг занимает различное время от 5 минут при постановки минимальных параметров до суток если параметра максимальны. Открыв полученный файл *.dlg в котором нас интересуют всего одно – энергия связывания. Находим строчку Estimated Free Energy of Binding на против которой стоит число.
-- отличная энергия связывания -15 и ниже
-- средняя энергия связывания -10 - -15
--слабая энергия связывания -3 - -8
3.6. Просмотр полученного взаимодействия
Analis -> Dokings -> Open...
Conformations -> Play. . .
|
