Лекция на тему: Генные сети и транскрипционные механизмы регуляции координированной экспрессии генов (Компьютерный дизайн генных сетей).

Генная сеть - группа координировано функционирующих генов, обеспечивающих формирование определенного фенотипического признака организма (молекулярного, биохимического, физиологического, морфологического, поведенческого и т.д.) Обязательные компоненты генной сети: гены, кодируемые ими РНК и белки, метаболиты, пути передачи сигналов, метаболические пути, регуляторные контуры с положительными и отрицательными обратными связями.

В настоящее время в мировой научной литературе имеются сотни тысяч публикаций, в которых представлены экспериментальные данные о различных особенностях регуляции экспрессии генов про- и эукариот.

Для систематизации и накопления информации об особенностях экспрессии генов эукариот в составе генных сетей и взаимодействиях между генами в лаборатории теоретической генетики разрабатывается база данных GeneNet. Технология GeneNet позволяет эксперту реконструировать генную сеть на основе аннотации экспериментальных данных, опубликованных в научных статьях.

Компоненты генных сетей могут быть разделены на 2 класса – элементарные структуры, такие как гены, РНК, белки и метаболиты, и элементарные события, такие как реакции и регуляторные события.

На рисунке представлены примеры графического представления элементарных структур и событий в базе GeneNet.

Условные обозначения приведены справа внизу. Показано, как изображаются процессы транскрипции, трансляции, мультимеризации белков, ферментативные реакции, фосфорилирование, активация либо подавление экспрессии.

Технология GeneNet обеспечивает реконструкцию генных сетей различных типов.

На этом рисунке показан фрагмент реконструированной генной сети клеточного цикла (Go/G1-S переход).

Ее особенностями являются:
1) наличие путей передачи сигналов, активирующиеся в результате взаимодействия ростового фактора с мембранным рецептором активирующего машину клеточного цикла при Go/G1-S переходе.
2) наличие трех центральных регуляторов – транскрипционных факторов Р53, димера E2F-1/DP-1 и тримера E2F-1/DP-1/pRB активирующих (ингибирующих) большие кассеты генов.

Экспрессия одного гена изменяется координированным образом с другими генами из генной сети.

Координированная экспрессия генов - это когда каждый ген экспрессировался в нужном количестве:
       - в нужном месте (тканеспецифичность)
        -в нужное время (индуцибельность, зависимость от этапа развития, стадии клеточного цикла или дифференцировки).

Транскрипционные механизмы регуляции координированной экспрессии генов у прокариот.

У прокариот (Представитель -E.coli = кишечная палочка) инициация транскрипции осуществляется комплексом РНК полимераза – сигма фактор. Сигма фактор специфическим образом узнает некую область перед стартом транскрипции. Эта область называется промотором. Роль сигма фактора как раз и заключается в распознавании нужного участка, потому что следующие этапы транскрипции (инициация, элонгация, терминация) осуществляются только при участии полимеразы.

Промотор – участок, прилегающий к старту транскрипции. Содержит регуляторные элементы, которые опознаются с белками, обеспечивающими инициацию транскрипции. Коровый промотор – участок приблизительно –40 +50. Промоторный район – 5’ фланкирующий район вплоть до старта транскрипции.

Анализ последовательностей более 100 различных промоторов E.coli выявил сходное строение:
1) в районе старта транскрипции – пурины, часто «САТ»
2) в позиции «-10» гексамер TATAAT (последовательность «–10»)
3) в позиции «-35» гексамер TTGACA (последовательность «–35»)
4) расстояние между последовательностями «-35» и «-10» ~16-18 нуклеотидов.

Комплекс сигма фактор – РНК полимераза (E.coli) имеет субъединичный состав. Помимо сигма фактора в него входят четыре субъединицы РНК полимеразы: 2 альфа, бета и бета'. Они выполняют разные функции. Только сигма фактор отвечает за распознавание промоторной области.

Организм E.coli имеет несколько сигма факторов, специфичных для различных ситуаций, которые распознают промоторы разных групп генов. Располагая этими данными, и анализируя промотор с неизвестной функцией, можно предсказать, какой сигма фактор будет с ним взаимодействовать. Следовательно, можно предвидеть ситуацию, в которой будет экспрессироваться ген. Таким образом, сигма факторы с разным молекулярным весом являются ключевыми факторами, координирующими экспрессию генов в генных сетях регулирующих ответ на тепловой шок, дефицит азота и хемотаксис.

Рассмотрим другую особенность регуляции транскрипции эукариот. Она состоит в том, что многие гены организованы в опероны.

Оперон – это группа из нескольких генов, транскрибируемых одновременно. Транскрипция инициируется с одного промотора. Таким образом, в любой ситуации в клетке образуются равные количества белков, кодируемых генами одного оперона. На слайде представлена структура лактозного оперона. Он включает гены бета- галактозидазы, пермеазы и трансацетилазы. Белки пермеаза и бета галактозидаза вовлечены в метаболизм лактозы в клетке. Первый белок обеспечивает поступление лактозы в клетку. Второй – является ферментом, обеспечивающим расщепление лактозы. Благодаря тому, что гены экспрессируются в составе оперона, в клетке нарабатываются равные количества транспортных белков и ферментов. Это обеспечивает эффективное усвоение лактозы, поскольку в определенных ситуациях экспрессия оперона может быть активирована, а в других, наоборот, репрессируется.

У прокариот координированная экспрессия генов обеспечивается на транскрипционном уровне за счет:
- наличия нескольких типов сигма факторов
- объединения групп генов в опероны.

Транскрипционные механизмы регуляции координированной экспрессии генов у эукариот.

У эукариот инициация транскрипции осуществляется сложным комплексом белков. В его состав входят как полимераза 2, так и так называемые базальные транскрипционные факторы. Согласно одной из моделей, этот комплекс формируется пошагово. На первом этапе происходит распознавание белком TFIID особой последовательности – ТАТА бокса. Hа следующих этапах присоединяются белки TFIIB, TFIIF, TFIIE, TFIIH.

Важную роль в регуляции транскрипции генов эукариот играют транскрипционные факторы. Это белки, специфически связывающиеся с участками ДНК в различных районах гена. Cайты связывания транскрипционных факторов могут располагаться как непосредственно перед стартом транскрипции (промоторная область), так и в удаленных регуляторных районах (энхансерах, либо сайленсерах).

Транскрипционные факторы влияют на интенсивность транскрипции

- взаимодействуя с белками базального транскрипционного комплекса напрямую
- или через другие белки (коактиваторы или корепрессоры)
- а также участвуя в ремоделинге хроматина.

Одна из форм координированной экспрессии генов – тканеспецифичность. Был проведен анализ экспрессии 36182 транскриптов мыши в 61 ткани. Это количество, практически сравнимое с количеством генов в геноме мыши. Выявлено, что среднее количество транскриптов, приходящихся на одну ткань, составляет 8200, то есть четвертую часть. Таким образом, видно, что в каждом типе клеток экспрессируется только часть генов генома.

На рисунке представлены промоторные районы некоторых генов человека из генной сети дифференцировки и созревания эритроцитов.

Показано расположение сайта связывания транскрипционного фактора GATA1. Справа приведены последовательности сайтов связывания. Они выровнены друг относительно друга таким образом, что становится возможным построить консенсус этого сайта. Данные о первичных последовательностях сайтов очень важны. Их анализ позволяет разрабатывать методы распознавания в ДНК.

Одна из форм координированной экспрессии генов - включение или выключение кассеты генов в ответ на индуктор или репрессор.

Например, экспрессия генов может координировано индуцироваться при низком уровне холестерина и репрессироваться при высоком уровне.

Это гены из генной сети регуляции уровня холестерина в клетке. Ряд генов кодирует ферменты пути биосинтеза холестерина и при их активной экспрессии холестерина в клетке нарабатывается много. В кассету генов, регулируемых холестерином, входит также рецептор частиц ЛПНП. При активации экспрессии этого белка активируется поступление холестерина внутрь клетки.

Экспрессия генов реагирует на изменение уровня холестерина при участии транскрипционного фактора SREBP (sterol regulatory element binding protein). Этот фактор присутствует в клетке в форме неактивного предшественника preSREBP. PreSREBP связан с мембранами эндоплазматического ретикулума. Расщепление неактивного предшественника активизируется, когда уровень холестерина в клетке низкий и замедляется, когда уровень холестерина повышается. Таким образом, гены из этой генной сети экспрессируются координированно, благодаря наличию центрального регулятора – SREBP.

Взаимодействие транскрипционных факторов с ДНК осуществляется специфическим образом. На рисунке приведены модели взаимодействия факторов из семейства ядерных рецепторов с ДНК. Видно, что если транскрипционный фактор является мономером, сайт связывания имеет один консервативный участок (мотив).

Если транскрипционный фактор - димер, сайт связывания содержит два повторяющихся мотива.

Предсказание сайтов связывания в регуляторных районах генов позволяет проводить реконструкцию генных сетей in silico.

Фрагмент генной сети включает две группы генов. О первой группе известно, что они регулируются фактором E2F/DP1 и эти данные подтверждены в экспериментальных статьях. Вторая группа генов имеет потенциальные сайты связывания факторов E2F/DP1, выявленные на основе компьютерного анализа. Таким образом, эта группа генов внесена в
генную сеть на основе анализа in silico.

Для управления генными сетями сложных процессов необходимо наличие многих регуляторов. Так, для клеточного цикла выявлена группа из восьми транскрипционных факторов. Анализ регуляторных районов генов клеточного цикла свидетельствует о том, что для каждого транскрипционного фактора имеется определенная временная точка, когда он наиболее активен. На рисунке представлены круговые диаграммы, где показана плотность потенциальных сайтов определенного фактора в регуляторных районах генов, экспрессирующихся на той или иной стадии клеточного цикла.

Была оценена вероятность встречаемости пар сайтов связывания транскрипционных факторов из этой группы в промоторах генов клеточного цикла. Выявлено, что определенные сочетания сайтов встречаются неслучайно часто. Это свидетельствует о том, регуляции с помощью так называемых, композиционных элементов. В этом случае факторы взаимодействуют как с ДНК, так и друг с другом и их эффект на транскрипцию усиливается синергичным образом.

Еще один способ регуляции транскрипции генов: наличие инсуляторов.
Инсулятор – участок ДНК, который, будучи помещенным между двумя регуляторными элементами, может препятствовать активирующему либо подавляющему действию одного элемента на другой.

Роль инсулятора может выполнять участок прикрепления к ядерному матриксу (MAR =matrix attachment regions), при включении такого инсулятора между энхансером и промотором. Два регуляторных района оказываются в различных доменах, и не способны взаимодействовать.

Еще один механизм регуляции транскрипции, который может определять интенсивность экспрессии многих генов - ацетилирование гистонов.

Гистоновые белки имеют положительно заряженные концевые фрагменты, которые могут взаимодействовать с отрицательно заряженными фосфатами сахарофорсфатного остова ДНК. Это взаимодействие стабилизирует комплекс ДНК с белками. Ацетилирование (присоединение ацетильной группы СО3СО) концевых фрагментов гистоновых белков нейтрализует их положительный заряд. Как следствие, электростатическое взаимодействие белков с ДНК ослабляется. Появляется возможность взаимодействия ДНК с некоторыми транскрипционным факторами.

И наконец еще один механизм регуляции транскрипции – метилирование ДНК. В эукариотических клетках уровень метилирования ДНК часто коррелирует с уровнем экспрессии гена. Метилированные участки ДНК транскрибируются менее активно, чем неметилированные участки. Наиболее часто метилированию подвергаются цитозиновые нуклеотиды, стоящие после гуаниновых.

Активность экспрессии каждого отдельного гена зависит от всей совокупности механизмов, о которых говорилось выше. Коэкспрессируемые гены могут находиться на разных хромосомах, и тогда ведущую роль в координации их экспрессии играют транскрипционные факторы. Если же гены находятся на одной и той же хромосоме в непосредственной близости друг от друга, сходный паттерн их экспрессии, возможно, определяется такими механизмами, как метилирование ДНК, ацетилирование гистонов, наличие LCR и инсуляторов.