Аннотация.  Разработано  программное  обеспечение  для  построения математической  модели  стационарного  метаболизма  растущей  клетки, позволяющее  производить  расчёт  оптимальных  экономических коэффициентов  роста  биомассы  и  выделения  продуктов  биосинтеза, достижимых  при  идеальной  регуляции  процессов,  и  соответствующее  этим оптимальным режимам метаболизма распределение скоростей реакций внутри клетки и в её компартментах, включая скорости обмена метаболитами между компартментами.  Созданная  программа FLUX II  работает  в  среде Windows.

Программа  имеет  удобный  интерфейс,  обеспечена  средствами, исключающими  зацикливание  алгоритма  и  позволяющими  производить содержательный анализ построенной модели. Программа обеспечивает также представление  результатов  расчета  и  анализа  модели  в  цифровой  и графической  форме.  С  помощью  созданной  программы  построена математическая модель стационарного метаболизма клетки E.coli, и рассчитан наилучший возможный экономический коэффициент для роста биомассы этой клетки  в  аэробных  условиях  на  глюкозе  и  соответствующее  этому  режиму метаболизма распределение скоростей реакций. Показано удовлетворительное согласие  результатов  расчетов  и  анализа  с  данными,  полученными  в эксперименте.  Обсуждены  возможные  пути  использования  программы  при решении практических задач современной биотехнологии.

Введение
Существование  живой  клетки  полностью  определяется  её  метаболизмом  - совокупностью  большого  числа  взаимозависимых  химических  реакций,  протекающих согласованно  во  времени,  скорость  протекания  которых  определяется  белками-ферментами.  В  результате  метаболических  реакций  осуществляется  воспроизведение всех  структурных  и  функциональных  молекулярных  компонентов  клетки, определяющих её существование в качестве живой системы, т.е. реализуется основное свойство живой клетки – её способность к самовоспроизведению. Метаболизм клетки включает в себя сотни реакций и является сложной саморегулирующейся системой.

В  настоящее  время  метаболизм  клеток  многих  прокариотических  организмов (таких  как  Escherichia coli,  Bacillus subtilis, Clostridium acetobutylicum  и  ряда  других) подробно  и  всесторонне  изучен.  Накопленные  знания  используются  для  построения математических  моделей  происходящего  в  них  обмена  веществ.  С  помощью  таких моделей можно решать не только фундаментальные, но и прикладные задачи.

Известно,  что  эволюционное  развитие  организма  и  формирование  его  генотипа происходит, в конечном счете, в результате случайного мутагенеза и фенотипической селекции.  Генная  инженерия  позволяет  искусственно  изменять  генотип  клетки  и, следовательно,  её  свойства  в  нужном  направлении.  При  этом  используется итеративный  подход,  который  заключается  в  выделении  фрагмента  метаболизма, который  определяет  некоторое  свойство  клетки,  последующего  проведения определенных  генноинженерных  манипуляций  для  модификации,  исключения  или создания  заново  генов  ферментов,  которые  определяют  функционирование выделенного  фрагмента  метаболизма.  В  результате  получается  усиление  или ослабление интересующего свойства клетки.  Как правило, один и тот же продукт биосинтеза может быть получен несколькими метаболическими  путями,  проходящими  через  разные  промежуточные  этапы  и отличающихся  распределением  скоростей  реакций  на  этих  этапах.  Математическое моделирование  позволяет  найти  и  проанализировать  все  возможные  варианты получения  продуктов  биосинтеза  и  найти  среди  них  тот,  который  является  в определенном смысле оптимальным.  Процесс  моделирования  метаболизма  клетки  предполагает  то  или  иное количественное  описание  биохимических  реакций,  составляющих  процесс  её жизнедеятельности, системой уравнений. 

Можно моделировать метаболизм, используя традиционный кинетический метод, обычно применяемый в химии. При этом составляются дифференциальные уравнения, описывающие  изменения  во  времени  концентраций  метаболитов,  участвующих  в реакциях.  Модель  метаболизма  клетки  в  этом  случае,  будет  представлять  собой систему  нелинейных  дифференциальных  уравнений,  включающих  большое  число кинетических  констант,  величины  которых  должны  быть  получены  из  эксперимента.

Решение  таких  систем  нелинейных  уравнений  связано  с  большими  математическими трудностями,  которые  до  появления  современных  вычислительных  мощностей представлялись  вообще  непреодолимыми.  Дело  ещё  серьёзнее  осложняется  тем,  что получение  достоверных  экспериментальных  данных  для  всех  входящих  в  уравнения кинетических  констант  практически  невозможно.  По  данным  статьи  только  для нескольких  метаболических  путей,  а  именно  для  путей  гликолиза  и  метаболизма аденина  в  эритроцитах  человека,  известны  все  входящие  во  все  уравнения кинетические константы. 

Далее,  упомянутый  в  нашей  задаче  критерий  оптимальности,  который  должен обеспечить  изучаемый  объект,  например,  максимальный  выход  некоторого  продукта, означает, что объект должен находится в стационарном состоянии. В самом деле, пусть выход продукта изменяется во времени, например, растёт. Тогда максимум выхода ещё не достигнут, то есть, изучаемый объект ещё не находится в нужном для нас состоянии и так далее. Широко известны два способа получения стационарных решений системы дифференциальных  уравнений.  Нужно  либо  решать  задачу  Коши  на  большом интервале времени, либо находить корни правых частей уравнений. В нашем случае ни один из указанных способов практически не осуществим. Это делает кинетический подход практически непригодным для математического моделирования метаболизма клетки в целом в настоящее время.

Другим,  значительно  более  эффективным  подходом,  позволяющим  уже  в настоящее  время  построить  модель  метаболизма  клетки  в  целом,  является  метод баланса  стационарных  метаболических  потоков.  Этот  подход  отличается  от кинетического  тем,  что  при  нём  моделируется  не  изменение  концентраций метаболитов  во  времени,  а  картина  распределения  скоростей  метаболических реакций.  При  таком  подходе  модель  метаболизма  представляет  собой  систему линейных  алгебраических  уравнений,  переменными  которой  являются  скорости метаболических  реакций  в  стационарном  состоянии  метаболической  системы. Параметрами  модели  в  этом  случае  являются  стехиометрические  константы метаболических реакций, хорошо известные в настоящее время.

В 1984  г. Papoutsakis  предложил  использовать  метод  баланса  стационарных метаболических  потоков  для  построения  математической  модели  метаболизма Clostridium acetobutylicum, продуцента ряда органических растворителей. Построенная модель,  включающая 14  реакций,  позволила  количественно  описать  процесс биосинтеза  растворителей  культурой  продуцента  Clostridium acetobutylicum  и некоторых  его  штаммов  при  росте  на  глюкозе  в  хорошем  соответствии  с экспериментом. Предложенный подход был развит в1999 г путем введения и учета некоторого  количества  нелинейных  ограничений,  полученных  с  использованием измеренных в эксперименте кинетических констант. Независимо метод баланса стационарных метаболических потоков был применён другими  исследователями [4, 5]  для  построения математической модели метаболизма глюкозы.  В  этих  моделях  моделировался  лишь  небольшой  фрагмент  метаболизма клетки,  и  они,  разумеется,  еще  не  могут  считаться  моделью  метаболизма  клетки  в целом.

Стационарное  течение метаболических  реакций (т.е.  протекание  всех  реакций  с постоянной  скоростью)  наблюдается  в  клетках  растущих  с  постоянной  скоростью (например, бактериальные клетки на экспоненциальной стадии роста). Для этого случая метод  баланса  стационарных  метаболических  потоков,  в  принципе,  позволяет построить полную модель метаболизма, происходящего в живой растущей клетке. Подход  к моделированию метаболизма  клетки  в целом  с использованием метода баланса стационарных метаболических потоков был впервые предложен и осуществлён в 1986  в  России Л.Н. Дроздовым–Тихомировым c  сотр.  (объект моделирования – метаболизм  продуцента  лизина  Corynebacterium glutamicum).  Эта  работа  была продолжена в последующие годы и её результаты частично опубликована.

 В западной литературе подход к моделированию метаболизма клетки, основанный на  методе  баланса  стационарных  метаболических  потоков,  в  начале 90-х  годов  был предложен  Стефаном  Шустером [9],  а  затем  получил  независимое  развитие  в многочисленных работах Б. Палсона с соавторами под названием Flux Balance Analysis (FBA).  В  работах  группы  Б.  Палсона  потоковый  подход  был  широко использован  для  конструирования  математических  моделей  метаболизма  кишечной палочки  Escherichia coli  и  пекарских  дрожжей  Saccharomyces cerevisiae  и  анализа  с помощью  построенных  моделей  экономических  характеристик  метаболизма  этих микроорганизмов.  Использование  метода  баланса  стационарных  метаболических потоков при исследовании метаболизма различных микроорганизмов  в работах  групп Б. Палсона и Л.Н. Дроздова-Тихомирова с сотрудниками продемонстрировало большие возможности  этого  подхода  для  построения  математических  моделей  метаболизма растущей клетки в целом.

Эффективность  применения  потокового  подхода  для  построения математических моделей  метаболизма  клетки  и  исследования  с  их  помощью  свойств  клетки  как сложной  биохимической  системы,  во  многом,  зависит  от  используемых математических методов  и  программ. Последние  должны  быть  разработаны  с  учетом необходимости максимальной автоматизации сложной процедуры построения модели, решения соответствующих систем уравнений и представления полученных результатов в удобном для понимания виде.

Эта  важная  при  использовании  подхода  для  решения  конкретных  задач  сторона дела практически не освещена в опубликованных работах Б. Палсона. В работах Л.Н. Дроздова-Тихомирова используется разработанный в 1985 году пакет программ FLUX, ориентированный  на  работу  в  среде DOS.  Программное  обеспечение FLUX  имело неудобный интерфейс и обладало серьезным недостатком – чувствительностью к тому в  каком  порядке  перечислены  реакции  моделируемой  системы  в  задающем моделируемую  систему  списке  биохимических  реакций.  Подбор  вручную  порядка перечисления  реакций,  при  котором  программа FLUX  находит  решение  задачи распределения скоростей в системе, может занять неопределённо большое время, что в некоторых  случаях  сильно  затрудняет  работу.  Кроме  того,  результаты  расчета представляются  программой FLUX  в  не  очень  удобном  для  понимания  и  сравнения виде.

Задачей  настоящей  работы  было  создать  программу,  работающую  в  среде Windows,  максимально  автоматизирующую  построение  модели  с  удобным интерфейсом,  с  возможностью  представления  результатов  в  любом  виде  по  выбору исследователя (в  том  числе,  и  в  графическом)  и,  что  самое  главное,  свободную  от указанного  выше  недостатка  программы FLUX,  связанного  с  зацикливанием  в некоторых случаях алгоритма линейного программирования.

Принципы построения потоковой модели полиферментной системы Потоковый подход (метод баланса стационарных метаболических потоков), который может  быть  использован  для  построения  математической  модели  метаболизма  клетки, опирается  на  закон  сохранения материи. Уравнения  потоковой модели  составляются  для системы  взаимодействующих  метаболитов,  являющейся  открытой  термодинамической системой,  находящейся  в  стационарном  состоянии  обмена  с  внешней  средой.  В  этом состоянии система с постоянной скоростью включает в себя определённые метаболиты из внешней среды – субстраты. Поток субстратов является входным материальным потоком. Вошедшие  в  клетку  субстраты  вступают  между  собой  в  реакции,  образуя  множество внутренних  компонентов  системы –  промежуточных  метаболитов,  или  интермедиатов. Концентрация  каждого  интермедиата  в  системе  в  стационарном  состоянии  остаётся постоянной  за  счёт  того, что  суммарная скорость притока из всех реакций, в которых он образуется, равна суммарной скорости оттока в реакциях, в которых он потребляется. На определенном  этапе  в  системе  происходят  необратимые  реакции,  в  результате  которых образуются “продукты” – метаболиты, не вступающие более в реакции с промежуточными метаболитами. Эти  продукты  накапливаются  с  постоянной  скоростью,  образуя  выходной материальный  поток  метаболизма.  Согласно  закону  сохранения  материи  атомарный состав и количество атомов вещества в выходном потоке должны быть равны атомарному составу и количеству атомов во входном потоке.

Уравнения  потоковой  модели  представляют  собой,  фактически,  запись  закона сохранения материи  для  пула  каждого  из метаболитов  рассматриваемой метаболической системы,  включая  субстраты  и  продукты.  Для  интермедиатов,  концентрации  которых  в системе  остаются  постоянными,  уравнения  баланса  потоков  записываются  как  равенство между  суммарной  скоростью  притока  из  всех  реакций,  в  которых  они  образуются,  и суммарной скоростью оттока во все реакции, в которых они потребляются. Для продуктов и  субстратов, уравнения баланса  записываются  как  равенство  скоростей их притока (или оттока) некоторым постоянным величинам, задаваемым при постановке задачи. Ясно, что величины  задаваемых  скоростей  накопления  продуктов (выходной  поток)  и  притока субстратов (входной поток) не должны противоречить закону сохранения материи.  Совокупность уравнений баланса потоков, написанных для каждого из компонентов метаболической  системы,  образует  систему  уравнений,  являющуюся  потоковой математической моделью рассматриваемой метаболической системы. Построение потоковой модели метаболизма клетки  Метаболизм  клетки,  находящейся  в  стадии  стационарного  роста,  можно  считать стационарным.  Для  построения  потоковой  математической  модели  стационарного метаболизма некоторой конкретной клетки требуются следующие данные...