Биотехнология меняет взгляды - BioinforMatix.ru - портал по биоинформатике, имейджингу и биософту
Биотехнология меняет взгляды |
|
|
| Автор Неизвестен | |
| 21.10.2008 г. | |
|
Биотехнология предполагает другую систему взглядов как на уже существующие биологические «машины», так и на конструирование новых. Однако многие генетические конструкции, которые
хотелось бы создавать биотехнологам, гораздо масштабнее, чем те, что
удается получить данным методом. Даже совсем простая цепочка генов
может состоять из нескольких тысяч звеньев. А геном такого крошечного
организма, как бактерия, иногда содержит несколько миллионов
нуклеотидов. Живые
организмы используют для синтеза своих ДНК ферменты - различные
полимеразы. Они способны присоединять до 500 нуклеотидов в секунду,
исправляя по ходу дела ошибки, вероятность которых равна примерно 10-9.
По всем показателям клеточная биосинтетическая машина превосходит самый
лучший ДНК-синтезатор в триллион раз (последнему на присоединение
каждого очередного звена нужно 300 секунд). Более того, in vivo в
репликации длинного генома (например, бактериального) одновременно
участвуют несколько полимераз, суммарная «производительность» которых
составляет 5 млн. нуклеотидов за 20 мин. Один
из нас (Дж. Черч) попытался реализовать такой параллелизм in vitro,
приспособив уже существующую технологию мультиплексных систем, основой
которых служит твердая подложка с фиксированными на ней короткими
одноцепочечными сегментами ДНК (олигонуклеотидами) длиной 50-70
звеньев. Их синтезируют одновременно прямо в ячейках подложки
фосфорамидитным методом. На одном квадратном сантиметре подложки
содержится миллион таких ячеек (точек). Каждая из них в нашем
устройстве имеет диаметр около 30 мкм и из нее «растут» до 10 млн.
олигонуклеотидов. Чтобы иметь возможность выборочно изымать их из
системы, мы присоединили к ним отщепляемые линкеры. Олигонуклеотиды
из разных точек имеют перекрывающиеся концевые последовательности, так
что из них можно в дальнейшем собирать более длинные сегменты ДНК,
например, целые гены. Следует заметить, что в процессе синтеза
нуклеотидных последовательностей возможны ошибки, и каждый
«неправильный» олигонуклеотид должен быть выявлен и удален, для чего мы
используем две разные корректирующие системы. Первая
включает синтез так называемых олигонуклеотидов-селекторов,
комплементарных целевым (их получают с помощью такой же мультиплексной
системы, как и та, что описана выше). Селекторные олигонуклеотиды
отсоединяют от подложки и инкубируют их с олигонуклеотидами,
фиксированными на первой матрице. В результате гибридизации взаимно
комплементарных олигоцепей образуются двухцепочечные сегменты ДНК.
Любое несоответствие между первыми и вторыми олигонуклеотидами приводит
к нарушению в спаривании оснований и указывает на наличие ошибки в
последовательности. Такой олигонуклеотид сразу отбраковывается.
Конечно, ошибки могут содержать не только целевые олигонукеотиды, но и
селекторные, несмотря на то, что их получали тем же способом, но
вероятность, что ошибочная последовательность из одного набора найдет
себе комплементарного «партнера» из другого, крайне мала. В результате
первого этапа коррекции и отбраковки мы получаем набор
олигонуклеотидов, содержащий всего одну ошибку на 1300 звеньев. Вторая
корректирующая система представляет собой точную копию той, что
функционирует в живых организмах. Один из нас ( П . Модрич) 10 лет назад
впервые воссоздал в деталях весь процесс и назвал систему Mut S, L, H.
Если при гибридизации цепей ДНК нарушается каноническое правило
спаривания А - Т, G - С, то в этом месте в двойной спирали появляется
дефект. MutS, природный белок, распознает нарушения, связывается с тем
участком ДНК, где оно произошло, и привлекает два других белка, MutL и
MutH, к коррекции ошибки. Дж. Джекобсон в сотрудничестве с Питером
Карром (Peter Carr) из Массачусетского технологического института,
используя данную систему, уменьшил вероятность ошибки синтеза ДНК до 10-4, что вполне приемлемо при сборке небольших цепочек генов. Параллелизм
в синтезе ДНК и использование систем коррекции позволяют собирать
протяженные, почти не содержащие ошибок генетические элементы гораздо
быстрее и при меньших затратах, чем раньше, что создает необходимую
базу для производства биодеталей, которое, как и в случае с
полупроводниками, будет быстро совершенствоваться. |
|
| Последнее обновление ( 20.04.2009 г. ) |
| « Пред. | След. » |
|---|