В НИИ физико-химической медицины (НИИ ФХМ) ФМБА состоялся семинар по геномике «Стандарт MIQE – новый подход к обеспечению качества геномных исследований». Подобного рода мероприятия ежегодно устраивает компания «Био-Рад Лаборатории» на протяжении последних шести-семи лет.

«Эти семинары выигрышно выделяются в ряду аналогичных мероприятий. Они помогают слушателям и в практической, и в научной работе улучшить показатели и качество получаемых результатов, – отмечает Вадим Говорун, заместитель директора по науке НИИ физико-химической медицины ФМБА. – Семинары ориентированы на специалистов, работающих в тех областях, которые сегодня называют “науками о жизни”. “Био-Рад Лаборатории” за свои средства проводит мероприятия, которые, по большому счёту, призваны организовывать научное сообщество, заполняя тот вакуум, который уже давно образовался в нашей стране».

Семинары обычно собирают десятки участников, что свидетельствует о большом интересе научного сообщества к обсуждаемым темам. В этот раз в НИИ ФХМ приехали учёные из Новосибирска, Калининграда, Санкт-Петербурга и других городов.

«Тему, связанную со стандартами, мы предложили в связи с тем, что многие исследования в области ПЦР реального времени проводятся с нарушением технологии, – пояснил Мирослав Телков, специалист компании «Био-Рад Лаборатории». – Если на каждом этапе это делать некорректно, то ошибки накапливаются, и в конечном счёте вы измеряете “грязность” своей работы. К сожалению, большая часть исследований, которая проведена в этой области, грешит очень высокой вариабельностью и невоспроизводимостью».

Для решения этой проблемы ряд специалистов, гуру в области ПЦР реального времени – Jo Vandesompele, Stephen A. Bustin, Mikael Kubista, Michael W. Pfaffl – объединили свои усилия и разработали стандарт MIQE, который появился около года назад.

На семинаре выступил один из его разработчиков – Джо Вандесомпеле, профессор Гентского университета (Ghent University, Belgium). Он впервые прибыл в Москву и, по его признанию, «счастлив находиться здесь».

Его доклад был посвящён новым подходам в исследовании экспрессии генов. Методов оценки экспрессии много. Лидером является ПЦР (полимеразная цепная реакция) в реальном времени.
У этого метода, по словам Джо Вандесомпеле, очень много преимуществ: это и точность, и чувствительность, и большой динамический диапазон. При желании может быть реализован высокопроизводительный анализ.

Однако надо учитывать, что полимеразная цепная реакция лишь на первый взгляд проста. В действительности это очень чувствительный метод – настолько, что малейшее изменение схемы его проведения (вплоть до того, насколько лаборант аккуратно работает с пробирками, в которых предстоит амплифицировать ДНК) способно резко трансформировать картину результатов анализа. Так что крайне важно на всех этапах исследования соблюдать требования по их проведению.

«Мне часто задают вопрос, что является приемлемым качеством для проведения анализа, – объясняет г-н Вандесомпеле. – К сожалению, на него нет однозначного ответа. В данном случае влияние оказывает совокупность факторов. Но первое, на что я хотел бы обратить внимание, – для получения корректных результатов ПЦР очень важно качество исходного образца».

В стандарте MIQE разработчики попытались свести воедино все критерии, которые должны выполняться. В общей сложности определено 75 параметров: как выделять РНК, контролировать эффективность амплификации и т.д. Все эти требования необходимо теперь соблюдать специалистам, выполняющим исследования в области ПЦР реального времени. И если они хотят разместить статью в серьёзном научном журнале, то должны предоставить редактору и референтам информацию о соответствии стандарту. Только в этом случае материал принимается к публикации.
В связи с действием нового стандарта учёные надеются, что удастся повысить качество геномных исследований.

Вадим Говорун в своём докладе более детально охарактеризовал проблему. По его словам, в настоящее время используется множество разных технологий по геномной биологии. Иногда даже специалист, который плотно занимается методической базой и разрабатывает технологии, не может уследить за всем происходящим. Революционный взрыв произошёл 5–6 лет назад. Тогда появились первые секвенаторы из так называемого следующего поколения после Сенгера (в конце 1960-х годов Ф. Сенгер разработал метод секвенирования РНК). Практически все методы, которые сегодня применяются в биологии, так или иначе относятся к категории постгеномных, то есть используется не только генная информация (о гене и о кластере генов), но и о геномах. Поэтому необходимо следить не только за адекватностью количественных, но и качественных методов измерения.

Хотя геном и не является количественным признаком, но процедура его прочтения проводится не настолько безошибочно, как это было при сенгеровских технологиях. «Резкое увеличение мощности и удешевление самой процедуры анализа привели к тому, что стали возможны существенные семантические ошибки, – подчеркнул Вадим Говорун. – А это принципиально важно, поскольку мы говорим о фундаменте измерений (как о фундаменте для зданий, от которого зависит, будет ли стоять постройка или рухнет)».

Сегодня в мире нет специалистов, которые могут визуально, интеллектуально проверять тот объём информации, который генерируется при современных высокопроизводительных методах анализа. Эти данные не поддаются альтернативной обработке, как это было раньше. Можно только выборочно следить за тем, что происходит с «продуктами интереса».

Новые методики, которые появились 1–3 года назад в геномных центрах мира и которые только сейчас входят в практику российских лабораторий, приводят к очень большому количеству ошибок. Всё это послужило тому, что в высокорейтинговых научных журналах стали появляться статьи о недостоверных исследованиях, отметил Вадим Говорун. Если раньше вероятность ошибок и дискредитации в этих изданиях была редка, то сегодня это стало почти нормой.

В связи с этим возникла инициатива стандартизации. Но есть и другая перспектива – двигаться в сторону осмысленного получения результатов. Инициатива MIAPE посвящена протеомике. В ней столкнулись с аналогичными проблемами гораздо раньше, потому что геномы стали известны и доступны с 1995 года. Критически проанализировав (на уровне физических законов) то, что было сделано при накоплении геномов, аналогичная комиссия, которая проповедует правила в транскрипционном анализе, пришла к выводу, что многие данные, полученные до 2007 года в протеомике, должны быть либо ревизованы, либо отменены – как недостоверные. Исследователи проработали больше 10 лет, опубликовали много статей в журналах, а потом стало понятно, что большинство этих инвентарных протеомных технологий, которые использовались, не очень достоверны с точки зрения идентификации белков. Всё было начато почти с чистого листа.

Вывод, который делает Вадим Говорун, прост: к тому, что происходит сегодня в геномике, должен быть более осторожный подход. Кроме того, следует придерживаться старых правил, которые существуют в биологии. Во-первых, при получении сверхинтересных результатов неплохо бы подтвердить их какими-то альтернативными технологиями. Во-вторых, надо проверять качество не только получаемой информации, но и используемой. Если вы работаете с геномами, то любые ошибки в самом геноме приведут к тому, что будут существенно варьироваться конечные выкладки, которые делаются в ходе эксперимента. Наконец, все эти технологии довольно дороги, надо не только следовать определённым рекомендациям и регламентам, выработанным различными комиссиями в этом сегменте, но и помнить о такой науке, как статистика. Многие исследователи считают, что новые технологии дают исчерпывающую информацию. А это не всегда так.