План лекции

«Лечение генов» и «лечение генами». Что такое генотерапия?
Стратегии коррекции генетических дефектов
Механизмы коррекции генетических дефектов.
Заместительная и коррегирующая генотерапия
Методы переноса генов в клетки человека
Вирусные векторы
Невирусные векторы
Генотерапия с помощью антисенс-олигонуклеотидов
Генотерапия моногенных болезней
Генотерапия семейной гиперхолестеринемии
Генотерапия онкологических заболеваний
Генотерапия инфекционных болезней
Проблемы и перспективы генотерапии

Генотерапия. Определение. Историческая справка

Лечение путем введения в ткани или клетки последовательностей ДНК

«Лечение генов» - исправление дефекта в гене (моногенные болезни) – на уровне соматических и половых клеток – замена мутантного гена на нормальный. Теоретические преимущества. Практическая сложность.

«Лечение генами» - коррекция дефекта путем введения полноценного работающего гена (кДНК). Не только моногенные болезни. Практически осуществимо.

Генотерапия – лечение (коррекция) заболеваний (наследственных, многофакторных, приобретенных (инфекционных), онкологических) путем введения в ткани или клетки больного чужеродной (отсуствующей у него) генетической информации (генов) с целью направленного изменения генных дефектов или придания клеткам новых функций.
 Концепция о лечении болезней на уровне генетических механизмов
 Практическое ее воплощение в развитие терапевтических мер

1980. Мартин Клайн (UCLA). Талассемия, рекомбинантный ген бета-гемоглобина. 2 пациента. Без успеха, но и без вреда. Запрещение наблюдательного совета UCLA.
1990. Майкл Блэз, Кеннет Калвер, у. Френч Андерсон (NIH). Тяжелый комбинир. иммунодефицит (ТКИД) – дефект гена аденозиндезаминазы (АДА). Ашанти ДеСильва (4 года). Введение модифицированных Т-лимфоцитов с нормальным АДА. Ex vivo. Ретровирусный вектор.
Синтия Катсхолл (7 лет). Модифицированные стволовые клетки с геном АДА. Опубл. В 1995. ПЭГ-АДА
Комитет по пищевым продуктам и лек. преп. (FDA) и косультативный комитет по рекомбинантной ДНК.
1992. СГХ и гемофилия В
1993. Муковисцидоз и болезнь Гоше
1995. 100 проектов и 400 пациентов (86 проектов по онкологическим болезням), СПИД
2000. 380 протоколов (63%-опухоли, 14% - моногенные болезни, 9%-инфекционные, 14%- прочие (МФЗ) и 3200 пациентов (68% - опухоли; 9% - моногенные; 13% - инфекционные).
2000. Слушания в комиссии сената по здравоохр. по поводу смерти пациента при генотерапии

Стратегии коррекции генетических дефектов

Генная терапия половых и соматических клеток
Наиболее радикальный и эффективный способ – замена дефектного гена в половых клетках. Практические сложности (низкая эффективность встраивания). Этические проблемы.
Генотерапия на уровне соматических клеток – ткань, опр. тип клеток. Все практические подходы.

Заместительная и коррегирующая генотерапия
Коррегирующая (исправляющая) терапия – замена дефектного гена нормальным
Заместительная терапия – ведение дополнительной копии(й) гена, которая функционально (но не физически) замещают дефектный ген
Оба подхода – коррекция фенотипа. Коррегирующая в отношении фенотипа.

Механизмы коррекции генетических дефектов
Коррекция утраченной функции клетки путем доставки в клетку «здорового» гена, который «компенсирует» неработающий ген клетки.
Подавление избыточной функции клетки. Применяют когда клетка приобретает несвойственную ей в норме функцию (деление при опухолевых заболеваниях, репликацию чужеродного генома при вирусных инфекциях)
Усиление иммунного ответа. Введение информации в клетки, которые осуществляют иммунный ответ, либо в клетки, против которых нужно усилить ответ (например, модификация антигенов опухолевых клеток).

Методы переноса генов в клетки человека

Решающим условием успешной генотерапии является обеспечение эффективной доставки, то есть трансфекции (в широком смысле) или трансдукции (при использовании вирусных векторов) чужеродного гена в клетки-мишени, обеспечение длительного функционирования его в этих клетках и создание условий для полноценной работы гена (его экспрессии).
Ex vivo – трансформация клеток вне организма (in vitro) и перенос трансформированых клеток в организм
In vivo – в организме человека. Перенос в клетки in situ.

Трансфекция может проводиться с использованием чистой ("голой" - naked) ДНК, легированной (встроенной) в соответствующую плазмиду, или комплексированной ДНК (плазмидная ДНК, соединенная с солями, белками (трансферрин), органическими полимерами (DEAE-декстран, полилизин, липосомами или частицами золота), или ДНК в составе вирусных частиц, предварительно лишенных способности к репликации.