 В классических учебниках молекулярной биологии структура мРНК эукариот охарактеризована весьма чётко — метилированный гуанин, связанный через трифосфатную группу с 5’-концом РНК (5’-кэп), 5’-нетранслируеамая область (НТО) с сайтом «посадки» рибосомы, кодирующая белóк последовательность, 3’-НТО и поли( А )-хвост. Наличие последнего считается критическим фактором — отщепление поли( А )-хвоста, или деаденилирование, вызывает деградацию мРНК. Однако последние работы показали, что поли( А ) является не единственно возможной 3’-терминальной последовательностью — к этому «хвосту» может быть дополнительно присоединён поли(У)-«хвостик» различной длины.
Известно, что матричная РНК (мРНК) является главным посредником между ДНК и белок-синтезирующим аппаратом. У прокариотических организмов только что транскрибированная мРНК функционально активна и начинает транслироваться немедленно. У эукариот же после транскрипции пре-мРНК подвергается созреванию. Только правильно созревшая мРНК транспортируется из ядра в цитоплазму и служит матрицей для синтеза белка.
Поскольку количество вновь синтезированного белка прямо пропорционально количеству содержащейся в цитоплазме соответствующей мРНК, регуляция времени жизни последней является критическим фактором, регулирующим скорость синтеза белкá. Нарушения этой регуляции ведут к катастрофическим процессам, — в частности, потере контроля над основными процессами в клетке и трансформации клетки в раковую. Поэтому любая мРНК имеет схожую структуру — кодирующая область в центре и регуляторные фрагменты по краям (рис. 1).
Рис. 1. Строение мРНК эукариот. Любая мРНК начинается с кэпа (от англ. cap — шапка, кепка) — метилированного остатка гуанина, который присоединён нестандартной связью (через три фосфатных группы). Наличие кэпа критично для функционирования мРНК в клетке. За ним следует 5’-нетранслируемая область (НТО), которая не кодирует белóк: её функция — «узнавание» рибосомы и регулирование трансляции. Сама кодирующая область начинается после «стартового» нуклеотидного триплета АUG и заканчивается стоп-кодоном (UGA или другими). За стоп-кодоном следует 3’-НТО, которая также важна для регуляции синтеза белка. Заканчивается вся молекула поли( А )-хвостом, который, как оказалось, всё-таки может состоять не только из аденозинов, но также включать остатки уридина (см. текст).
Основной механизм регуляции известен: на 3’-конце каждой мРНК находится регуляторная последовательность, состоящая практически полностью из одного нуклеотида — аденозина ( А ), из-за чего она и получила название поли( А )-хвост. Её длина регулируется рядом ферментов — она может и удлиняться, и обрезаться. Известно, что почти всегда длина поли( А )-хвоста определяет время жизни (точнее, полураспада) всей молекулы. Когда поли( А )-хвост укорачивается настолько, что не может более выполнять свои функции (связывать регуляторный комплекс белков), происходит отрезание кэпа ферментом Dcp1. Стандартная схема распада мРНК начинается с постепенного деаденилирования 3’-конца экзонуклеазой PARN. После этого мРНК уже не может участвовать в инициации транскрипции, и расщепляется экзонуклеазами.
Кстати, поли( А ) несёт ещё и вторую, дополнительную функцию регуляции трансляции, неожиданно красивую по своей логичности. Если рибосома не встречает стоп-кодона (например, при мутации или сдвиге рамки считывания), то после трансляции некодирующей области рибосома доходит до поли( А )-хвоста, и последний транслируется в виде поли-лизинов на С-конце мутантного белка. Эта поли-лизиновая последовательность является нефизиологической, и резко нарушает трехмерную структуру белка. Дефектные белки быстро распознаются протеасомами и расщепляются. Вслед за этим распознаётся и деградирует сама мутантная мРНК [1].
В общем, наличие и функции поли( А )-хвоста неоспоримо важны. Но недавно оказалось, что не только поли( А ) выполняет роль такого регулятора. Было открыто явление уридинилирования 3’-конца мРНК, т. е. модификация поли( А )-хвоста поли-уридином (поли(У)) [2]. Обнаружилось, что поли( А )-хвост может модифицироваться одним или многими остатками уридина, что, по-видимому, ведёт к инициации расщепления мРНК. Такой механизм уже обнаружен у ряда организмов (одноклеточных водорослей Chlamydomonas reinhardtii, дрожжей Schizosaccharomyces pombe, лягушки Xenopus laevis, цветкового растения Arabidopsis thaliana) и, вероятно, будет обнаружен и у многих других.
Такая распространённость заставляет взглянуть на поли-уридинилирование мРНК как на универсальный второй путь регуляции «жизни» мРНК в клетке. Сведений пока ещё очень мало, но уже открыта белковая машинерия, обеспечивающая «пришивку» уридина к мРНК, — это семейство терминальных уридиниловых терминаз (TUTases, PUPases) [3]. Ранее было известно, что они модифицируют некоторые малые ядерные РНК (например U6) и таким образом стабилизируют их структуру и время жизни. Однако в случае мРНК, модификация её «поверх» поли( А ) уридином (достаточно всего нескольких нуклеотидов) вызывает узнавание мРНК специальным комплексом вызывающих деградацию ферментов — Lsm1–7, — которые запускают процесс деградации мРНК по стандартной схеме: деаденилирование, декэпирование и экзонуклеазное расщепление. И хотя наличие нескольких уридинов на 3’-конце может показаться не очень важной деталью, всё-таки это не так. Для этого сделаем короткий экскурс в методы современной молекулярной биологии.
Мониторинг мРНК в клетках (как тотальной, так и отдельных типов) на сегодня является одним из самых точных методов для описания состояния клетки и, соответственно, — целых органов. Дело в том, что ДНК является стандартной «базой данных», одинаковой во всех тканях организма (с некоторыми оговорками, на которых мы тут останавливаться не будем). Однако намного более важно узнать, какие гены и с какой интенсивностью активируются в каждой ткани или органе. Самая ценная информация — это уровень экспрессии индивидуальных генов в определённый отрезок времени. Анализ профиля синтеза белков по регистрации присутствия самих белковых молекул может быть недостаточно точен, поскольку многие белки довольно стабильны и могут сохраняться достаточно долгое время. Кроме того, основной метод их регистрации — при помощи антител (Вестерн-блоттинг) — довольно капризен, и не во всех случаях может помочь. По этой причине анализ присутствия самих белков не во всех случаях может дать ответ на многие вопросы, которые можно получить, анализируя содержание мРНК и профили её экспрессии. Анализ «спектра» мРНК даёт намного более ценную информацию об активности генов — за счёт короткого времени жизни РНК в цитоплазме мы всегда узнаём самые «свежие» новости, а сам метод намного более чувствителен (за счет ПЦР-амплификации исходных образцов).
Основной подход к исследованию мРНК базируется на методе обратной транскрипции (рис. 2), происходящем из открытия Д. Балтимором, Р. Дульбекко и Г. Теминым явления обратной транскрипции у вирусов (Нобелевская премия по физиологии и медицине, 1975). Ими был описан фермент обратная транскриптаза, который, используя молекулу РНК в качестве матрицы, строит вторую, комплементарную, цепь, но уже ДНК. Такая одноцепочечная комплементарная ДНК получила название кДНК (cDNA). Лабораторными методами эту кДНК можно «умножить» в миллионы раз и сохранить для последующего анализа. На методе обратной транскрипции базируются многие современные методы исследования для анализа клеточной системы транскрипции-трансляции.
Однако тут есть один нюанс — чтобы обратная транскрипция началась, нужна короткая стартовая «затравка» (праймер), которая была бы комплементарна 3’-концу РНК (см. рис. 2). До сегодняшнего дня в качестве универсального праймера в основном использовался олигонуклеотид поли(Т), комплементарный поли( А )-хвосту. Теперь, когда оказалось, что поли( А )-хвост не столь уж инвариантен, возникает вопрос: является ли «универсальный» поли(Т)-праймер настолько уж универсальным? В свете описанного открытия, возможно, он может не связываться и не выявлять целые пулы мРНК с уридинами на 3’-конце, которые оказываются фактически «невидимыми» для традиционных алгоритмов в молекулярной биологии. А если учесть, что метод обратной транскрипции на основе поли(Т) и последующая ПЦР-диагностика являются сейчас основными инструментами для определения экспрессии генов, открытие альтернативных 3’-концов может вызвать необходимость пересмотреть истинность целых массивов данных, которые сегодня считаются исходной базой для молекулярных исследований.
Литература
1. Ito-Harashima S., Kuroha K., Tatematsu T., Inada T. (2007). Translation of the poly(A) tail plays crucial roles in nonstop mRNA surveillance via translation repression and protein destabilization by proteasome in yeast. Genes Dev. 21, 519–524;
2. Rissland O.S., Norbury C.J. (2009). Decapping is preceded by 3’ uridylation in a novel pathway of bulk mRNA turnover. Nat. Struct. Mol. Biol.;
3. Marzluff W. (2009). A new way to initiate mRNA degradation. Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 613–614
|
