Одной из актуальных задач биотехнологической
промышленности и медицины в современной России является создание
универсальной постгеномной технологии для разработки нового поколения
лекарственных препаратов. Разработкой комплексной постгеномной платформы для рационального
конструирования оригинальных биологически активных соединений,
использующих в качестве мишеней мембранные белки (ММБ) или
непосредственно мембраны клеток, занимаются сегодня ученые из Института
биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю. А . Овчинникова
Российской академии наук (ИБХ РАН). По мнению руководителей
проекта, академика РАН В.Т. Иванова и доктора химических наук,
профессора А .С. Арсеньева, решение задачи основано на выявлении
взаимосвязи между пространственной структурой, динамикой и функцией
ММБ. Именно способ трехмерной укладки полипептидной цепи белка и
параметры динамической подвижности такой системы определяют
молекулярные механизмы действия белков. В частности, от этого зависят
характеристики их взаимодействия с мембраной клетки и с другими
молекулами: лигандами, пептидами и белками, нуклеиновыми кислотами и
т.д. Исследователи планируют использовать несколько типов ММБ:
интегральные мембранные рецепторы, ионные каналы и их фрагменты,
мембраноактивные молекулы (антимикробные пептиды, антибиотики белковой
природы) и др. Платформа будет включать комбинированное применение
современных методов генетической и белковой инженерии, химии белка,
структурной биологии, химического синтеза, методов биологического
тестирования и высокопроизводительных вычислительных технологий.
Природные и рекомбинантные изотопно-меченые ММБ, их пространственная
структура с атомным разрешением и динамика, а также влияние ММБ на
поведение мембран будут охарактеризованы с помощью методов ЯМР, ЭПР,
конфокальной спектроскопии и рентгеноструктурного анализа. При
проведении протеомных исследований будут использованы методы
масс-спектроскопии. По мнению разработчиков, экспериментальные данные
послужат основой для создания надежных и эффективных методов
компьютерного моделирования пространственной структуры и поведения ММБ
в биологических мембранах, поиска и конструирования новых
высокоэффективных и высокоаффинных лигандов. Платформа,
объединяющая ряд постгеномных технологий, принципиально изменит и
ускорит исследование взаимодействия биологически активных молекул с
ММБ, позволит выявить их влияние на процессы в живых клетках.
Разработанные технологии и продукция на их основе (прототипы
лекарственных препаратов) станут конкурентоспособными на мировом рынке
и будут ориентированы на массовое применение в научно-исследовательских
организациях, в фармацевтической и биотехнологической промышленности, в
медицине. Они также будут способствовать борьбе с распространенными
заболеваниями, не имеющими в настоящее время адекватной терапии.
Возможные области их применения — диагностика, терапия и лечение
сердечно-сосудистных, нейродегенеративных, раковых заболеваний и
болезней, вызываемых вирусными (СПИД, гепатит С, грипп), бактериальными
и грибковыми инфекциями. Высокопроизводительный скрининг лигандов
Важный этап проекта — анализ взаимодействия лигандов (низкомолекулярных
соединений, пептидов, пептидомиметиков) с ММБ. Технологии
высокопроизводительного скрининга лигандов к ММБ-мишеням основываются
на применении как экспериментальных, так и теоретических методов.
Исследователи используют методы ЯМР-скрининга, что позволяет проводить
скрининг препаратов с производительностью до 100 веществ в день. Кроме
того, применяются и компьютерные методы высокопроизводительного
компьютерного докинга, в процессе которого моделируется взаимодействие
лигандов с ММБ. Также задействованы и усовершенствованные алгоритмы
докинга белков-рецепторов с пептидами и другими белками. Применение
компьютерных технологий позволяет значительно ускорить поиск и
оптимизацию высокоаффинных и селективных лигандов, а также снизить
стоимость работ. Современные программы докинга производят поиск
конформаций комплексов на основании оптимизации эмпирических оценочных
функций, однако наилучшие по значениям оценочной функции результаты
докинга далеко не всегда согласуются с экспериментальными данными. С
целью повышения надежности и предсказательной силы программ докинга
учитывается конформационная подвижность белка-мишени, разрабатываются
дополнительные к оценочной функции критерии для выбора «правдоподобных»
конформаций комплексов белок-лиганд. Рис. 1. Классы мембранных и мембрано-активных белков и пептидов, изучаемых в рамках проекта.
Активные природные и рекомбинантные ММБ Разрабатываемая
технологическая платформа включает в себя и создание технологии
скрининга антимикробной активности, фракционирования и многостадийного
тестирования полипептидов из бактерий, грибов, ядов пауков и пр.,
высокоэффективные экспрессионные системы для получения полноразмерных
интегральных ММБ, а также их фрагментов (например, трансмембранных
пептидов). Ученые также проводят скрининг белков-партнеров для
гибридной экспрессии и оптимизирование условий получения гибридных
белков в виде «телец включения». С целью получения образцов, обладающих
нативной структурой, они используют протоколы выделения, очистки,
рефолдинга и солюбилизации ММБ в мембраноподобных средах (мицеллы
детергентов, липидные бислои, бицеллы и пр.). Указанные оригинальные
технологии используются и для наработки изотопно-меченых ММБ, их
точечных мутантов. Для тестирования и оптимизации условий солюбилизации
и рефолдинга применяется широкий набор физических методов (ЯМР-, масс-
и флуоресцентная спектроскопия, КД, ИК и др.). Методы сравнительной протеомики Для
изучения протеома биологических мембран и связанного с ним пула
регуляторных пептидов (пептидома) разработчики используют самые
современные методы нано-хроматографии и тандемной масс-спектрометрии с
ионизационными технологиями MALDI и ESI. Имеющееся оборудование
позволяет определять молекулярную массу белков, пептидов и их
комплексов (вплоть до 100 кДа), а также идентифицировать их
пост-трансляционные модификации при количестве вещества в образцах
1 пмоль. Белки, составляющие протеом биологических мембран, и их
предшественники будут идентифицированы с привлечением
высокопроизводительных биоинформационных подходов и геномных баз
данных. При решении этих задач будут применены оригинальные технологии
солюбилизации ММБ. Для изучения связывания ММБ с лигандами при помощи
масс-спектрометрических методов используется процедура селективного
изотопного мечения белков и пептидов, разработанная в ИБХ РАН. Учеными
также созданы новые методические подходы к масс-спектрометрическому
анализу клеточных и тканевых пулов регуляторных пептидов — сложных
многокомпонентных смесей, получаемых из природных источников. Кроме
того, с помощью масс-спектрометрии решаются задачи создания и
идентификации лигандов, обладающих высокой аффинностью и селективностью
по отношению к конкретным представителям протеома мембран.
Рис. 2. Этапы высокопроизводительной
технологии разработки прототипов лекарственных препаратов на основе
природных биологически активных соединений и de novo дизайна.
Технологии молекулярного моделирования
Для компьютерного анализа пространственной структуры и динамики ММБ, а
также для оценки их эффектов на биологические мембраны ученые применяют
оригинальные, не имеющие аналогов в России, методы молекулярного
моделирования ММБ и мембраноподобных сред (липидных бислоев и мицелл
детергентов различного состава). Для выполнения расчетов они используют
методы молекулярной динамики и Монте-Карло, а также реализующие их
оригинальные и стандартные программы, адаптированные для
высокопроизводительных параллельных вычислительных комплексов. Кроме
того, на этапах выбора стартовых конформаций моделируемых систем, а
также для анализа получаемых результатов применяют созданные авторами
методы исследования гидрофобной/гидрофильной организации белков и
мембран, картирования свойств их поверхностей и т.д. На основании
полученных результатов авторы проекта создают структурно-динамические
модели ММБ в мембранах, что позволит исследовать процессы связывания
лигандов с ММБ-мишенями, предсказывать мембранолитическую активность
выделенных либо проектируемых новых соединений (пептидов,
низкомолекулярных лигандов, пептидомиметиков и пр.). Для компьютерного
конструирования соединений, обладающих высокой аффинностью и
селективностью к заданным ММБ-мишеням, исследователи используют
современные технологии высокопроизводительного докинга. С целью
повышения надежности и предсказательной силы алгоритмов докинга
производят учет конформационной подвижности белка-мишени, разрабатывают
оригинальные критерии выбора «правдоподобных» конформаций комплексов
белок-лиганд. Разработчики проекта, ученые из Института
биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю. А . Овчинникова
Российской академии наук, совместно с коллегами из Института
физико-химической биологии им. А .Н. Белозерского МГУ, Института
кристаллографии им. А .В. Шубникова РАН, биологического факультета МГУ и
факультета молекулярной и биологической физики МФТИ полагают, что
предлагаемая к разработке технология должна придать инновационную
направленность фундаментальным исследованиям ММБ и мембран. Применение
новой платформы обеспечит прочную научную базу для разработки и
внедрения в фармацевтическую промышленность и медицинскую практику
нового поколения высокоэффективных и широкодоступных лекарственных
препаратов. Рис. 3. Технология направленного
ингибирования роста опухолевых клеток с помощью искусственно созданных
трансмембранных пептидов-«перехватчиков».
|