В настоящее время во всем мире растет интерес к получению природных
биологически активных соединений (БАС), меченных стабильными изотопами ( 2Н,
13С, 15N, 18О и др), которые необходимы для многочисленных биохимических и
диагностических целей [1], структурно-функциональных исследований [2], а также
для изучения клеточного метаболизма [3]. Тенденции к предпочтительному
использованию стабильных изотопов по сравнению с радиоактивными аналогами
обусловлены отсутствием радиационной опасности и возможностью определения
локализации метки в молекуле спектроскопией 1Н ЯМР [4, 5], ИК- и
лазерной спектроскопией [6], а также масс-спектрометрией [7]. Развитие
технической и компъютерной оснащенности аналитических методов позволило
существенно повысить эффективность проведения биологических исследований de
novo, а также изучать структуру и механизм действия БАС на молекулярном
уровне [8]. Большое научно-прикладное значение в этом аспекте имеют соединения
нуклеиновой природы, содержащие дейтериевую метку в углеродном скелете молекулы
[9]. В частности, 2Н-меченые рибонуклеозиды в ближайшем будущем
смогут найти применение в матричных синтезах молекул дейтерированных РНК для
изучения их пространственной структуры и конформационных изменений [10].
Важным моментом в исследованиях с применением изотопно меченых БАС
является их доступность. Дейтериймеченые БАС могут быть синтезированы с
использованием химических, ферментативных и биосинтетических методов [11, 12].
Однако химические синтезы часто многостадийны, требуют больших расходов ценных
реагентов и меченых субстратов и приводят к конечному продукту, представляющему
собой рацемическую смесь D- и L-форм, для разделения которых
требуются специальные методы [13]. Более тонкие синтезы меченых БАС связаны с
комбинацией химических [14] и ферментативных подходов [15, 16]. Стратегия
синтеза изотопно-меченых БАС более подробно освещена в работе ЛеМастера
[17].
Для многих научно-практических
целей биотехнология предлагает альтернативный химическому синтезу
биосинтетический метод получения дейтериймеченых БАС, который приводит к
высоким выходам синтезируемых продуктов, к эффективному включению дейтерия в
молекулы и к сохранению природной конфигурации синтезируемых соединений [18].
Традиционным подходом при этом остается предложенный Креспи метод выращивания
штаммов-продуцентов в средах с максимальными концентрациями дейтерия [19].
Однако основным препятствием является недостаток 2Н-меченых ростовых
субстратов с высоким уровнем дейтерированности. Прежде всего это связано с
ограниченной доступностью и дороговизной самого высокоочищенного дейтерия,
выделяемого из природных источников. Природная распространенность дейтерия
составляет лишь 0.015% (относительно общего количества элемента), однако
несмотря на невысокое содержание дейтерия в пробах разработанные в последние
годы методы обогащения и очистки позволяют получать 2Н-меченые
субстраты высокого уровня изотопной чистоты [20].
Начиная с первых экспериментов
Даболла и Кокса по выращиванию природных объектов в тяжелой воде,
разрабатываются подходы с использованием гидролизатов 2Н-меченой
биомассы как ростовых субстратов для синтеза штаммов-продуцентов БАС [21, 22].
Однако эксперименты обнаружили бактериостатический эффект 2Н2О,
заключающийся в ингибировании жизненно-важных функций клетки, оказываемой 40% 2Н2О
на растительные клетки [23] и 80-90% 2Н2О на клетки
простейших и бактерий [24]. Попытки использовать для синтеза в 2Н2О
природных объектов различной таксономической принадлежности, включая бактерии,
микроводоросли [25] и дрожжи [26] предпринимались в течение длительного
времени. Однако широкого распространения в биотехнологии они не получили ввиду
трудности синтеза, использования сложных комплексных ростовых сред, сложности
технологической схемы синтеза и т. п. Поэтому целый ряд практических вопросов
биосинтеза 2Н-меченых БАС в 2Н2О остается не
выясненным.
Более перспективны схемы синтеза с использованием в качестве 2Н-меченых
ростовых субстратов биомассы метилотрофных бактерий, ассимилирующих метанол по
рибулозо-5-монофосфатному (РМФ) и сериновому пути фиксации углерода, интерес к
которым возрастает благодаря интенсивному развитию технологии химического
синтеза метанола [27, 28]. Уровень ассимиляции биомассы метилотрофов клетками
простейших организмов и эукариот составляет 85-98%, а их производительность,
измеренная по уровню биоконверсии метанола в клеточные компоненты, достигает
50% [29]. Как было показано нами раннее, метилотрофные бактерии очень
неприхотливые объекты, растут на минимальных средах с 2-4% метанолом, в которых
другие контаминантные бактерии не размножаются и достаточно легко адаптируются
к максимальным концентрациям 2Н 2О, что существенно для
синтеза 2Н-меченых БАС [30, 31]. Большой научно-практический интерес
к использованию дейтерированной метилотрофной биомассы для синтеза продуцентов
рибонуклеозидов определил цель настоящей работы, связанной с изучением
принципиальной возможности биосинтеза 2Н-меченого инозина штаммом Bacillus
subtilis за счет использования гидролизата факультативных метилотрофных
бактерий Brevibacterium methylicum.
|
