|
Эффект от употребления алкогольных напитков известен практически
каждому, однако молекулярный механизм действия этанола на мозг долгое
время был совершенно не изучен — не было понятно даже, является ли
действие специфическим (то есть, основанным на механизме
лиганд–рецептор) или неселективным (когда этанол просто нарушает
физико-химическое равновесие внутренней среды организма). В свете
последних исследований можно отдать предпочтение первому варианту:
в структуре G-белóк–зависимых K+-каналов
входящего выпрямления мембран нейронов (GIRK) найден сайт, специфически
связывающий низкомолекулярные спирты, что активирует канал (независимо
от действия G-белкá) и меняет характер взаимодействия между нервными клетками.
Эффект действия этилового спирта на мозг известен человечеству ещё со времён, когда целенаправленное изготовление алкогольных напитков было делом далёкого будущего: известно, что приматы с удовольствием пьют естественным образом образовавшееся «вино», поедая перебродившие фрукты и ягоды, когда удаётся достать это «лакомство». Напитки, содержащие спирт, занимают почетное место во всех известных культурах — очевидно, не только из-за благородного вкуса некоторых из них, но и благодаря пьянящему действию, оказываемому ими на сознание.
Несмотря на крайне простое строение молекулы этилового спирта — «активного вещества» этих напитков — молекулярный механизм действия алкоголя на нервную систему долгое время был совершенно неизвестен; понятно было только, что он как-то нарушает взаимодействие между нервными клетками в мозгу. Мнения колебались между двумя крайними случаями: от варианта неспецифического взаимодействия — когда этанол сдвигает физико-химический и биохимический баланс организма (гомеостаз) и влияет, в частности, на свойства клеточных мембран, — до механизма лиганд-рецепторного взаимодействия. (Последний случай подразумевает существование особого рецептора спирта, который был неизвестен, и существование которого представлялось сомнительным с учётом малого размера молекулы этанола.)
Сравнительно недавно стали появляться биохимические данные, говорящие о чувствительности многих ионных каналов, присутствующих в мембранах нервных клеток (например, управляемых лигандами: γ-аминомасляной кислотой, глицином, ацетилхолином, серотонином и другими) к действию этанола и других низкомолекулярных спиртов [1, 2]. Ранние гипотезы объясняли этот эффект модификацией вязкости и текучести липидных мембран клеток, но позднее учёные стали склоняться к идее специфических сайтов связывания молекул спиртов в этих каналах.
Исследователи из института Солка в Калифорнии (США) подробно исследовали этот вопрос, и им удалось окончательно подтвердить гипотезу специфического взаимодействия спиртов с каналами белковой природы в нервных клетках [3]. Объектом их исследований стали (в отличие от уже упомянутых лиганд-управляемых каналов) мембранные калиевые каналы входящего выпрямления, также реагирующие на присутствие спиртов: G-белок–зависимые (GIRK, G-protein–gated inwardly rectifying potassium channel) и G-белок–независимые (IRK, G-protein–insensitive inwardly rectifying potassium channel) K+-каналы. Белки этого семейства являются мишенью действия многих токсинов; нарушение их работы приводит к ряду серьёзных заболеваний. Их особенностью является односторонняя проницаемость: они впускают ионы K+ в клетку более «охотно», чем выпускают их; одной из их функций считается поддержание потенциала покоя нейронов на заданном уровне. GIRK запускаются Gβγ-субъединицами G-белка, активируемого посредством ряда G-белоксопряжённых рецепторов (GPCR), — в частности, m2-мускаринового рецептора. (Другими известными представителями семейства мембранных рецепторов GPCR являются фоторецептор родопсин [4] и адренорецепторы [5].) Результатом их работы стала идентификация и характеристика молекулярных сайтов связывания молекул спиртов в структурах этих рецепторов.
Несколько лет назад этой же группой учёных была получена кристаллографическая структура цитоплазматического домена G-белок–независимого K+-канала входящего выпрямления (IRK1) со связанными молекулами спирта [6] (правда, это не этанол, а более крупный двухатомный 2-метил-2,4-пентадиол, МПД). Обнаружилось, что четыре «кармана», связывающих по молекуле спирта, образованы парами смежных субъединиц в составе тетрамера, формирующего активную форму канала IRK1. На основе структурного сходства каналов GIRK1 и GIRK2 с каналом IRK1 (структуры всех трёх цитоплазматических доменов известны) исследователи предположили общий механизм связывания спиртов этими рецепторами (см. рисунок).
Консервативные спирт-связывающие сайты в структурах K+-каналов входящего выпрямления IRK1 и GIRK2. ( А ). Структура цитоплазматического домена канала IRK1 в комплексе с молекулой двухатомного спирта 2-метил-2,4-пентандиола (МПД). Сайт связывания, образованный контактом двух смежных субъединиц, состоит из трёх структурных элементов: N-концевого участка, βL–βM «шпильки» одной субъединицы и βD–βE «шпильки» другой субъединицы. (На врезке схематично изображена структура одной субъединицы IRK-канала, включая поровую петлю, два трансмембранных сегмента и цитоплазматический домен, изображённый на этой картинке [показан пунктиром].) (Б, В). Детальное представление спирт-связывающих сайтов в комплексе с МПД в структуре канала IRK1 (Б) и в полученной по аналогии модели комплекса с GIRK2 (В). (Предполагаемое положение МПД во втором случае [показано пунктиром] получено путём совмещения структур цитоплазматических доменов IRK1–МПД и GIRK2.) (Г). Выравнивание аминокислотных последовательностей IRK1 и GIRK2 в области трёх структурных доменов, образующих сайт связывания спиртов (остатки, непосредственно формирующий сайт, обведены в рамку). (Д). Вольт-амперная характеристика канала GIRK2: базальный ток и активированный ток в присутствии 100 мМ МПД, составляющий ~246% от базального. Для сравнения приведён ток канала, ингибированного 1 мМ ионами Ba2+ (чёрным). Рисунок из [3].
Данные об активации каналов GIRK спиртами с числом атомов углерода до четырёх (метанолом, этанолом, 1-пропанолом и 1-бутанолом) и блокировании более длинными спиртами говорят об ограниченном объёме сайта связывания; эти же сведения легли в основу проведённого эксперимента по характеристике этого сайта с помощью точечного мутагенеза. Замена функционально важного аминокислотного остатка L257 в сайте (см. рисунок) на ряд других подтвердила, что взаимодействие осуществляется именно в этом месте, и показала, что объём сайта связывания спиртов и его гидрофобность являются критически важными параметрами: увеличение объёма замещающего остатка или усиление его полярных качеств снижает способность к активации в присутствии спиртов. Фактически, спирты активируют каналы IRK и GIRK «паразитным» образом, то есть, в обход активации через G-белóк. объём сайта связывания спиртов в структурах каналов GIRK составляет ~250 Å3, что позволяет связывать спирты настолько объёмные как МПД, действие которого на каналы GIRK аналогично действию этанола (однако н-пентанол и все более крупные линейные спирты уже ингибируют канал).
Что интересно, схожие по форме и объёму активные сайты обнаружены и в других белкáх, связывающих спирты, — в частности, в алкогольдегидрогеназе, расщепляющей этанол в клетках печени, и в белке дрозофилы LUSH, ответственном за рецепцию алкоголя в окружающей среде.
Активация каналов GIRK приводит к общему снижению активности нейронов, что согласуется с депрессорным влиянием алкоголя на центральную нервную систему. Исследователи считают, что это свойство может быть использовано при лечении эпилепсии, характеризующейся эпизодическими аномальными всплесками электрической активности мозга, внешне проявляющимися в виде печально известных припадков. «Если бы удалось разработать новое соединение, конкурирующее с алкоголем за связывание в активных сайтах GIRK-каналов, этим можно было бы подавлять вспышки ненормальной активности нейронов и, возможно, получить новое лекарство от эпилепсии», — говорит Пол Слезингер, руководитель исследования [7].
Эта работа финансировалось американскими институтами алкогольной зависимости и алкоголизма, так что результаты, возможно, будут использованы и в лечении более распространённого заболевания.
Литература
1. Mihic S.J. et al. (1997). Sites of alcohol and volatile anaesthetic action on GABAA and glycine receptors. Nature 389, 385–389;
2. Lovinger D.M., White G., Weight F.F. (1989). Ethanol inhibits NMDA-activated ion current in hippocampal neurons. Science 243, 1721–1724;
3. Aryal P., Dvir H., Choe S., Slesinger P.A. (2009). A discrete alcohol pocket involved in GIRK channel activation. Nat. Neurosci. 12, 988–995;
4. биомолкула: «Зрительный родопсин — рецептор, реагирующий на свет»;
5. биомолкула: «Новый рубеж: получена пространственная структура β2-адренорецептора»;
6. Pegan S., Arrabit C., Slesinger P.A., Choe S. (2006). Andersen’s syndrome mutation effects on the structure and assembly of the cytoplasmic domains of Kir2.1. Biochemistry 45, 8599–8606;
7. ScienceDaily: “Site For Alcohol’s Action In The Brain Discovered”.
|
