Хромосомный анализ и его методы - BioinforMatix.ru - портал по биоинформатике, имейджингу и биософту

Хромосомный анализ и его методы

Печать E-mail
Автор Назаренко С.  А ., Яковлева Ю.С.   
16.04.2009 г.
Методы приготовления препаратов хромосом

До 1959-1960 гг. получение качественных препаратов хромосом для проведения цитогенетического анализа представляло существен­ную проблему, поскольку для этой цели было необходимо исследо­вать клетки тканей, обладающих высокой пролиферативной актив­ностью, например кроветворной ткани костного мозга. К началу 60-х годов XX столетия усилиями нескольких исследователей был разра­ботан достаточно эффективный метод получения препаратов хро­мосом из лейкоцитов периферической крови человека. В 1959 году Хангерфорд с соавторами (Hungerford et al.) предложили метод крат­косрочного культивирования клеток периферической крови челове­ка in vitro,  а  в 1960 году Ноуэлл и Хангерфорд (Nowell, Hungerford) предложили применение в качестве митогена (стимулятора клеточ­ного деления.) выделенный из семян фасоли мукополисахарид фи-тогемагглютинин (ФГА), позволивший индуцировать in vitro деление покоящихся Т-лимфоцитов периферической крови. В том же году Мурхед с соавторами (Moorhead et al., 1960) предложили высуши­вать на воздухе раскапанную на предметные стекла клеточную сус­пензию делящихся клеток, что привело к созданию удобного цитоге­нетического метода, пригодного для диагностических целей.

По мере развития цитогенетики арсенал используемых методов непрерывно пополнялся. К настоящему времени, возможно изуче­ние всего хромосомного набора, отдельных хромосом и их участков в клетках практически любых тканей и органов, на любой стадии кле­точного цикла, в митозе и мейозе.

В зависимости от степени пролиферативной активности клеток разных тканей in vivo и in vitro различают прямые и непрямые мето­ды получения препаратов хромосом.

1)         Прямые методы используются при исследовании тканей, обла­дающих высокой митотической активностью (костный мозг, хори­он и плацента, клетки лимфатических узлов, ткани эмбриона на ранней стадии развития). Препараты хромосом готовятся непос­редственно из свежеполученного материала после специальной обработки.

2)    Непрямые методы включают получение препаратов хромосом из любой ткани после ее предварительного культивирования в те­чение различного периода времени.

Существует множество модификаций прямого и непрямого мето­дов приготовления хромосомных препаратов, однако основные эта­пы получения метафазных пластинок остаются неизменными:

1.          Использование колхицина (колцемида) - ингибитора образова­ния митотического веретена, который останавливает деление кле­ток на стадии метафазы.

2.          Гипотонический шок с использованием растворов солей калия или натрия, которые вследствие разницы осмотического давления внутри и снаружи клеток вызывают их набухание и разрыв меж­хромосомных связей. Такая процедура приводит к отделению хро­мосом друг от друга, способствуя более сильному их разбросу в метафазных пластинках.

3.          Фиксация клеток с использованием ледяной уксусной кислоты и этанола (метанола) в соотношении 3:1 (фиксатор Карнуа), что способствует сохранению структуры хромосом.

4.          Раскапывание суспензии клеток на предметные стекла.

5.          Окрашивание хромосомных препаратов.

В зависимости от стадии клеточного цикла, в которой находится исследуемая клеточная популяция возможно проведение следующих цитогенетических исследований:

- анализ отдельных хромосом и их участков в интерфазных ядрах (половой хроматин в ядрах буккального эпителия, оценка анеуп-лоидии,  а  также наличия или отсутствия относительно протяжен­ных участков ДНК в интерфазных ядрах любой ткани методом FISH-анализа);

-        профазных хромосом (анализ на стадии пахитены в сперматоге­незе);

-        прометафазных хромосом (высокий уровень разрешения);

-        метафазных хромосом (традиционный анализ ФГА-стимулирован-ных лимфоцитов периферической крови, фибробластов кожи, кле­ток костного мозга, амниотической жидкости

 

 -     стадий анафазы-телофазы (для регистрации специфического воз­действия различных мутагенных воздействий

 

Международная система цитогенетической номенклатуры хромосом человека и этапы ее развития

 

В 1960 году в американском городе Денвере была создана пер­вая Международная система цитогенетической номенклатуры хро­мосом человека (An International System for Human Cytogenetic Nomen­clature - ISCN), обеспечившая международную стандартизацию ис­следований хромосом еще на начальных этапах становления цито-генетики человека. Хромосомный набор или кариотип человека вклю­чает 46 хромосом - 22 пары аутосом и 1 пару половых хромосом (XX

-   у лиц женского пола и XY - мужского). В основу Денверской клас­сификации хромосом была положена их морфологическая характе­ристика: размер, форма и положение первичной перетяжки - цент­ромеры. Согласно данной номенклатуре хромосомы нумеруются от 1 до 23 по мере убывания их длины: с 1 по 22 - аутосомы,  а  23 пара

-   половые хромосомы. Самые крупные хромосомы человека, имею­щие первые номера, в среднем 5 раз длиннее самых мелких - 21 и 22 хромосом. В соответствии с положением центромеры хромосомы принято делить на 3 группы: метацентрические (центромера распо­ложена в середине хромосомы), субметацентрические (центроме­ра смещена от центра хромосомы) и акроцентрические (центроме­ра расположена в дистальной части хромосомы).

Все аутосомы согласно Денверской классификации были подраз­делены на 7 групп - от  А  до G. Группа  А  (хромосомы 1-3) - большие метацентрические хромосомы. Группа В (хромосомы 4 и 5) - вклю­чает большие субметацентрические хромосомы. Группа С (хромосо­мы 6-12) - среднего размера субметацентрические хромосомы. Груп­па D (хромосомы 13-15) - большие акроцентрические хромосомы. Группа Е (хромосомы 16-18) - включает короткие субметацентрические хромосомы. Группа F - (хромосомы 19 и 20) - маленькие ме-тацентрические хромосомы. Группа G - (хромосомы 21 и 22) - вклю­чает малые акроцентрические хромосомы. Половая Х-хромосома по длине и центромерному индексу (соотношению между длиной корот­кого и длинного плечей хромосомы) близка к хромосомам группы С,  а  Y-хромосома по величине и морфологии (при обычной окраске) близка к хромосомам группы G.

В дальнейшем номенклатура хромосом человека получила раз­витие на последующих международных цитогенетических конферен­циях в Лондоне (1963 г.) и Чикаго (1966 г.). Однако большой прогресс, достигнутый благодаря внедрению методов дифференциальной ок­раски, потребовал существенного дополнения данной номенклату­ры новыми принципами анализа сегментированных хромосом. В1971 году в Париже на IV международном конгрессе по генетике человека была согласована единая система идентификации хромосом чело­века, учитывавшая дифференцировку хромосом по длине.

Каждая хромосома набора человека при дифференциальной ок­раске характеризуется уникальным для нее сочетанием темно окра­шенных сегментов или полос (англ. - band), чередующихся с нео­крашенными участками или светлыми сегментами. Именно такое спе­цифическое для данной хромосомы сочетание сегментов позволяет четко ее идентифицировать и отличить от других хромосом набора. В пределах короткого (р) и длинного (q) плеча каждой хромосомы выделяют ряд четко идентифицируемых областей или регионов (англ. - region), которые нумеруются арабскими цифрами начиная от центромеры (сеп) к теломерному (tel) участку или терминаль­ному (ter) концу хромосомы. Каждая область хромосомы включает определенное число сегментов, нумерация которых (второй арабс­кой цифрой) также идет в направлении от центромерного к теломер­ному участку. Таким образом, обозначение хромосомного сегмента 2q34 означает хромосому 2, длинное плечо, 3 регион и 4 сегмент. Сама центромера обозначается сочетанием цифр 1 и 0, т.е. часть центромеры в пределах короткого плеча обозначается как- р10,  а  часть, включающая длинное плечо -q10.

Открытие в середине 70-х годов того факта, что профазные и про-метафазные хромосомы позволяют достичь большего числа сегмен­тов, чем метафазные хромосомы, и, следовательно, повысить раз­решающие возможности цитогенетического исследования, привело к разработке методов получения хромосом высокого разрешения и потребовало дополнения цитогенетической номенклатуры новыми принципами анализа таких хромосом. В1980 году по этому поводу в Париже было достигнуто международное соглашение, которое было опубликовано в 1981 году под названием "Международная система цитогенетической номенклатуры хромосом человека - сегментация хромосом высокого разрешения" или ISCN (1981). Так, если сегмент в пределах какой-либо хромосомы подразделяется на отдельные суб­сегменты, то после номера сегмента ставится точка, после которой указывается номер субсегмента. Например, если оригинальный сег­мент 1 р31 подразделяется на 3 разных субсегмента, то они обозна­чаются как 1р31.1, 1р31.2и 1р31.3, причем субсегмент 1р31.1 явля­ется проксимальным,  а  1 р31.3 - дистальным по отношению к цент­ромере. Дополнительное деление субсегментов на другие сегмен­ты, например субсегмента 1 р31.1, соответственно обозначается как 1p31.11,1р31.12 ит.д.

В1985 году была опубликована цитогенетическая номенклатура, учитывающая новую терминологию для характеристики приобретен­ных конституциональных хромосомных нарушений, выявляемых в опухолевых клетках- ISCN (1985). В 1991 году Международным ко­митетом по стандартизации цитогенетических исследований было опубликовано скорректированное "Руководство по цитогенетике рака" - ISCN (1991). Однако прогресс, достигнутый в дальнейшем благо­даря использованию нового метода молекулярной цитогенетики -флюоресцентной гибридизации in situ (FISH), потребовал дополне­ния цитогенетической номенклатуры новыми принципами молекуляр-но-цитогенетического анализа хромосомных нарушений. Такой до­кумент по стандартизации цитогенетических исследований, отража­ющий последние достижения в этой области, был опубликован в 1995 году-ISCN (1995).

Дифференциальная окраска хромосом

В зависимости от целей цитогенетического исследования исполь­зуются различные методы окрашивания хромосом. Наиболее рас­пространенными из них являются рутинная или обычная окраска и ряд методов дифференциального окрашивания хромосом: Q-, G-, С-, R- и NOR- или Ag-окраска. В свою очередь, методы диф­ференциального окрашивания делятся на 2 группы: 1) приводящие к образованию сегментов вдоль длины всех хромосом (например Q-, G- или R-сегменты); 2) приводящие к окрашиванию специфических хромосомных структур, в результате чего выявляется ограниченное число сегментов (С-, Т- или NOR-сегменты).

Рутинная окраска хромосом достигается путем простого окра­шивания полученных хромосомных препаратов красителем Романов-ского-Гимза (азур-эозином), без какой-либо их предварительной об­работки. Такая окраска приводит к сплошному прокрашиванию хро­мосом по длине, что не позволяет идентифицировать разные мор­фологически сходные хромосомы набора. Исторически рутинная ок­раска была самой первой используемой в цитогенетике человека окраской, активно применяющейся в течение 1959-1970 гг., до вне­дрения методов дифференциального окрашивания хромосом. В на­стоящее время она практически не применяется для диагностики кон­ституциональных хромосомных нарушений, однако находит приме­нение при анализе хромосомных аберраций в тестировании факто­ров среды на мутагенную активность.

Q-окраска (от англ. Quinacrine - акрихин) выявляется на хромо­сомах в виде чередования ярко- и темно-флюоресцирующих полос с помощью флуоресцентной микроскопии хромосомных препаратов, окрашенных такими флюорохромами (флуоресцентными красителя­ми) как производные акридина - акрихин дигидрохлорид (атебрин) или акрихин-иприт. Эти красители обладают способностью присое­диняться к ДНК путем интеркаляции или с помощью внешних ион­ных сил. Q-окраска имеет свою кодировку (QFQ) по международной цитогенетической номенклатуре. Заслуга применения производных акрихина для получения Q-сегментов на хромосомах человека при­надлежит шведскому цитогенетику Касперссону (1970). В популяци­ях человека существует межиндивидуальная вариабельность отдель­ных участков хромосом, выявляемых с помощью Q-окраски -Q-полиморфизм хромосом. Он выражается в особенно ярко светя­щихся сегментах, локализованных в центромерных участках (сеп) хро­мосом 3 и 4,  а  также в коротких плечах (р11) и спутниках (р13) всех акроцентрических хромосом человека 13-15,21 и 22. Кроме того, у лиц мужского пола ярко флюоресцирующейся областью является и дистальная часть длинного плеча хромосомы Y - сегмент q12. Этот участок Y-хромосомы обладает выраженным межиндивидуальным полиморфизмом и четко наследуется по мужской линии. Все пере­численные ярко флюоресцирующие участки хромосом являются об­ластями локализации гетерохроматина - некодирующих повторяю­щихся последовательностей ДНК, вариабельность которых не при­водит к каким-либо фенотипическим изменениям. Указанные выше ярко флюоресцирующие Q-полиморфные хромосомные сегменты являются удобными цитогенетическими маркерами и могут быть ис­пользованы как для характеристики популяций, индивидов и клеточ­ных линий, так и для решения некоторых судебно-медицинских про­блем.

G-окраска (от англ. Giemsa- Гимза) выявляется благодаря пред­варительной обработке хромосомных препаратов слабым раствором протеолитического фермента трипсина и последующей окраске кра­сителем Гимза. При этом наблюдается полосатая исчерченность хро­мосом, где темные полосы в некоторой степени соответствуют гете­рохроматиновым районам,  а  светлые-эухроматиновым. G-окраска имеет свою кодировку (GTG) по международной цитогенетической номенклатуре. Оптимальные условия окраски находят в каждой ла­боратории эмпирическим путем. Методика G-окраски хромосом че­ловека была впервые предложена английской исследовательницей Мариной Сибрайт (Seabright) в 1972 году и практически в неизмен­ном виде используется до настоящего времени. По числу, величине и расположению выявляющихся сегментов рисунок G-окраски ана­логичен рисунку при Q-окраске, где темно окрашенные G-сегменты соответствуют флюоресцирующим Q-сегментам. Различия состоят в том, что:  а ) несветящиеся гетерохроматиновые центромерные сег­менты в хромосомах 1 и 16 хорошо прокрашиваются красителем Гим­за; б) ярко флюоресцирующие при Q-окраске сегменты 3,4,13-15, 21, 22 и Y-хромосом не выделяются особой интенсивностью при G-окраске. На G-окрашенных метафазных хромосомах выделяется око­ло 320 сегментов на гаплоидный геном.

R-окраска (от англ. Reverse - обратная) отличается противопо­ложностью рисунка G-окраске. Темноокрашенными здесь являются эухроматиновые участки хромосом,  а  светлыми - гетерохроматино­вые. Существует несколько модификаций метода R-окраски и каж­дый из них имеет свою кодировку по международной цитогенетичес­кой номенклатуре. Наиболее приемлемой является обработка пре­паратов Ва(ОН)2 с прогреванием их при 60°С и последующей отмыв­кой в дистиллированной воде и окрашиванием раствором красителя Гимза. Кодировка R-окраски, полученной таким способом - RHG.

С-окраска (от англ. Constitutive heterochromatin - конститутивный гетерохроматин) выявляется в виде вариабельных по величине тем-ноокрашенных сегментов конститутивного гетерохроматина в прицен-тромерных районах хромосом, в то время как эухроматиновые учас­тки хромосом прокрашиваются очень бледно. Методы получения С- окраски могут варьировать, но важным условием является предва­рительная обработка препаратов щелочью с последующей двухча­совой инкубацией препарата в двукратном стандартном солевом растворе (2 X SSC) при 65°С. В качестве щелочных растворов обыч­но применяют гидрат окиси бария или натрия. Окраску препаратов производят красителем Гимза. С-окраска имеет свою кодировку (CBG) по международной цитогенетической номенклатуре. Конститутивный гетерохроматин построен преимущественно из многократно повто­ряющихся последовательностей ДНК, так называемой сателлитной ДНК, выявляемой во время градиентного центрифугирования хро­матина. В популяциях человека, также как и в случае Q-окрашива-ния, существует межиндивидуальная вариабельность по определен­ным участкам хромосом, в данном случае по величине блоков С-ге-терохроматина, выявляемых с помощью С-окраски (С-полиморфизм хромосом). По локализации выделяют 4 типа С-хроматина: 1) соб­ственно центромерный, присущий всем хромосомам, с относитель­но небольшими по площади темноокрашенными блоками; 2) более крупные блоки гетерохроматина, располагающиеся в прицентромер-ных районах длинных плечей аутосом 1, 9 и 16, обладающие четко выраженным межиндивидуальным полиморфизмом; 3) большой блок гетерохроматина дистальной части длинного плеча Y-хромосомы, заметно варьирующий по величине у разных лиц мужского пола; 4) гетерохроматин коротких плеч акроцентрических хромосом. Метод выявления центромерного гетерохроматина позволяет прежде все­го оценить хромосомный полиморфизм четырех хромосом набора -1, 9,16 и Y,  а  также используется в практике клинической цитогене-тики для уточнения характера структурных перестроек затрагиваю­щих данные хромосомы. По международной цитогенетической но­менклатуре увеличенные или уменьшенные блоки гетерохроматина обозначаются как qh+ или qh- (h - гетерохроматин). Например, за­пись кариотипа 46,XX,9qh+ означает, что у нормальной женщины имеется вариант хромосомы 9 с большим гетерохроматиновым бло­ком в длинном плече,  а  запись 46,XYqh- означает, что у мужчины име­ется уменьшение длины гетерохроматинового блока на длинном пле­че Y-хромосомы.

NOR-окраска (от англ. Nucleolar Organizer Region - Ядрышко-Образующие Районы -ЯОР) или Ag-окраска (серебрение)-приме­няется для выявления ядрышкообразующих районов, расположен­ных в коротких плечах (сегмент q12 - спутничная нить) всех 5 пар акроцентрических хромосом человека (13,14, 15, 21 и 22), с помо щью окрашивания солями серебра. Известно, что районы ядрышко-вых организаторов содержат гены рибосомальной РНК (рРНК). Еди­ница транскрипции генов рРНК содержит гены 5,8S, 18S и 28S РНК. Ряды рРНКтранскрипционных единиц располагаются тандемно вдоль ДНК и отделяются друг от друга нетранскрибируемыми последова­тельностями - спейсерами. Транскрибируемый район и нетранскри-бируемый спейсер тандемно повторяются примерно 40 раз в каждой из 5 пар акроцентрических хромосом, составляя около 400 копий ри-босомных генов на геном. В настоящее время для визуализации этих районов на метафазных хромосомах применяют метод серебрения Хоуэлла и Блэка (Howell, Black, 1980), основанный на использова­нии комбинации 50% раствора нитрата серебра с желатиновым про­явителем окраски в условиях прогревания препаратов при 60°С. С помощью этого метода сами хромосомы окрашиваются в желтый цвет,  а  в коротких плечах акроцентрических хромосом на спутничных ни­тях четко выделяются черные точечные образования - глыбки вос­становленного металлического серебра. Размеры этих глыбок, отра­жающие активность ЯОР, на разных хромосомах существенно варь­ируют - от отсутствия заметной окраски - до достаточно крупных блоков серебра (Ag-полиморфизм). Тонкие механизмы окраски яд­рышкообразующих районов хромосом пока неизвестны, но ясно, что красящим субстратом является не ДНК рибосомных генов и не рРНК,  а  кислые белки, связанные с ней. Для оценки данного типа хромо­сомного полиморфизма предложена полуколичественная 5-балль­ная система оценки активности ЯОР каждой из 5 пар акроцентри­ческих хромосом генома человека (0 - отсутствие окраски, 1 - сла­бая, 2 - средняя, 3 - сильная и 4 - очень сильная окраска ЯОР хро­мосом, при которой размеры Ag-блока значительно превышают тол­щину хроматид). При сложении баллов отдельных ЯОР может быть оценена активность всех 10 ЯОР генома по критерию суммарной функциональной активности ЯОР, предложенному Н. А . Ляпуновой с соавт. (1988). В популяциях человека существует межиндивидуаль­ный полиморфизм Ag-окрашенных хромосом, который выражается в специфичности степени окраски отдельных хромосом у разных ин­дивидов, являющейся наследуемой характеристикой.

Т-окраска (от англ. Telomere -теломера) - применяется для вы­явления теломерных районов хромосом в коротких и длинных пле­чах. Метод включает инкубацию препаратов хромосом при 87°С в течение 20-60 мин в растворе фосфатного буфера при рН 5,1 с пос­ледующей окраской раствором красителя Гимза.

 

Показания для проведения цитогенетического обследования

1.    Нарушение репродуктивной функции неясного генеза у мужчин
и женщин:

 а )   спонтанные аборты в разных сроках (2 и более),
мертворождения или рано умершие дети;

б)   первичная аменорея;

в)   мужская и женская стерильность при исключении
гинекологической патологии у женщин.,

2.           Наличие у ребенка множественных врожденных пороков развития (МВПР).

3.           Задержка умственного и физического развития у ребенка.

4.           Подозрение на хромосомную болезнь по клинической симптоматике:

 

-        изменения формы и размеров черепа (долихоцефалия, микро­цефалия, гидроцефалия, краниостеноз);

-        изменения вида лица и его пропорций;

-        аномалии конфигурации и расположения лба (низкий, выступа­ющий, килевидный, в форме трилистника и т.д.);

-        аномалии глаз (антимонголоидный разрез глаз, гипертелоризм, страбизм и т.д.);

-        аномалии подбородка (маленький, массивный, выступающий);

-        аномалии носа (седловидный, массивный, открытые и расши­ренные вверх ноздри и т.д.);

-        аномалии ушных раковин (деформированные, низко расположены);

-        аномалии челюсти (микроретрогнатия);

-        изменения пальцев (их соразмерности и деформация - клино-дактилия, камптодактилия, синдактилия; неправильное распо­ложение линий на ладони, например поперечная ладонная складка - "обезьянья борозда" и т.д.);

-        аномалии внешних гениталий;

-        изменения кожи и кожных придатков.

 

5.           Подозрения на синдромы, характеризующиеся хромосомной нестабильностью (учет хромосомных аберраций и СХО).

6.           Оценка мутагенных воздействий.

Последнее обновление ( 16.04.2009 г. )
 
« Пред.   След. »
<