Обогащение молекул
стабильными изотопами ( 2Н, 13С, 15N и другие)
в настоящее время является важным методом в разнопрофильных биохимических и
метаболических исследованиях с использованием аминокислот и других биологически
активных соединений (БАС) [1-3]. Тенденции к предпочтительному применению стабильных
изотопов по сравнению с их радиоактивными аналогами обусловлены отсутствием
радиационной опасности и возможностью определения локализации метки в молекуле
методами высокого разрешения, включая ЯМР [4], ИК- [5] и лазерную спектроскопию
[6] и масс-спектрометрию [7]. Развитие этих методов детекции стабильных
изотопов за последние годы позволило повысить эффективность биологических
исследований, а также изучать структуру и механизм действия клеточных БАС на
молекулярном уровне [8, 9]. В частности, аминокислоты, меченные 2Н, 13С,
15N с различными уровнями изотопного включения, применяются для
изучения пространственной структуры и конформационных изменений белков [10],
взаимодействия белковых молекул [11], а также в химических синтезах широкого
круга изотопномеченых соединений на их основе. Например, меченый L-фенилаланин
использован в синтезах пептидных гормонов и нейротрансмиттеров [12].
Важным
моментом в исследованиях с применением меченых аминокислот, является их
доступность. Изотопномеченые аминокислоты могут быть получены с использованием
химических, ферментативных и биосинтетических методов. Однако химические
синтезы часто многостадийны, требуют больших расходов ценных реагентов и
меченых субстратов и приводят в результате к продукту, представляющему собой
рацемическую смесь D- и L- форм, для разделения которых требуются
специальные методы [13]. Более тонкие синтезы меченых аминокислот связаны с
использованием комбинации химических и ферментативных подходов [14-16].
Для
многих целей и прежде всего для структурных исследований белков биотехнология
предлагает альтернативный химическому синтезу путь получения аминокислот,
меченных стабильными изотопами, который приводит к высоким выходам
синтезируемых продуктов, к эффективному включению изотопов в молекулы, и, самое
главное, к сохранению природной конфигурации синтезируемых соединений. При
биосинтетическом получении меченых аминокислот используют несколько подходов,
один из которых заключается в равномерном обогащении синтезируемых соединений
по всему углеродному скелету молекулы за счёт выращивания штаммов продуцентов
на средах, содержащих в качестве источников стабильных изотопов следующие
субстраты: 15NН 4Сl [17], ( 13С)метанол, ( 2Н)метанол
[18], и 2Н 2О [19]. Этот подход включает в себя также
комплексное использование химических компонентов биомассы, выращенной в
присутствии стабильных изотопов, для выделения и фракционирования нужных
изотопномеченых соединений. Другой подход заключается в сайт-специфическом
обогащении аминокислот по определённым положениям молекул за счёт ассимиляции
клеткой меченых предшественников, например, [1,4- 13С]сукцината, [1,
2- 13С]ацетата, [1- 13С]лактата и др. [20, 21]. Методы
получения изотопномеченых аминокислот в аспекте их использования для
ЯМР-исследований белков более подробно изложены в работах ЛеМастера [22].
Настоящая
работа является продолжением исследований [23-25], направленных на
биосинтетическое получение [2Н]- и [13С]аминокислот за
счёт утилизации низкомолекулярных меченых субстратов - (2Н)метанола,
(13С)метанола и 2Н2О в клетках микроорганизмов
и реализацию возможности определения стабильных изотопов методом
масс-спектрометрии электронного удара. Чувствительность масс-спектрометрии
составляет 10-9-10-11 нмоль, что существенно выше, чем
при использовании ИК- и ЯМР-спектроскопии. Данный метод в сочетании с
обращённо-фазовой ВЭЖХ хорошо зарекомендовал себя для исследования уровня
изотопного обогащения молекул аминокислот в составе их мультикомпонентных
смесей, каковыми являются препараты культуральных жидкостей штаммов-продуцентов
аминокислот и гидролизаты белков, полученные со сред, содержащих стабильные
изотопы
|
