Каждая биологическая жидкость, анализируемая методом 1Н ЯМР спектрометрии с частотой 800 МГц, имеет свой характерный спектр («отпечаток пальца»), что делает возможным идентифицировать нарушение метаболических профилей не только в крови или моче, но и в извлечениях из ткани клеточных суспензиях. Для этого используют специальные компьютерные программы, анализирующие основные компоненты (АОК) и классифицирующие образцы, согласно их ЯМР спектральным профилям (40, 63). В настоящее время эффективный способ извлечения важной метабономической информации состоит в комбинировании ЯМР-спектрометрии высокого разрешения определяемой биологической жидкости с мультивариантными методами статистики. Основные компоненты (ОК) — новые переменные, созданные от линейных комбинаций стартовых спектральных данных так, что каждый последующий ОК имеет определенное отличие от предыдущего, причем, первый ОК в сравнении с другими имеет разницу в наборе данных в наибольшей степени. Участок первых двух или трех ОК дает лучшее представление о разновидности набора данных в двух или трех измерениях.

Таким образом, создаются карты ОК, способные визуально отразить поведение образцов под влиянием любого ксенобиотика. «Рисунок» ЯМР-спектра биологической жидкости или образца ткани определен его метаболическим профилем (11, 18, 38-40, 64, 65. 76). Это достаточно простой подход для научных исследований. Однако в условиях протекания биохимических процессов in vivo все значительно сложнее, поскольку эффекты, вызванные генетической модификацией, болезнью, пищей, образом жизни, действием введенного препарата, развиваются в режиме реального времени. Для решения подобных многофакторных задач разработаны (и продолжают активно разрабатываться) автоматические методы классификации метабономических данных. На их основе строится математическая модель, предсказывающая правильный выбор класса для каждого образца. Расчетные данные сравнивают с экспериментально полученным ЯМР-метаболическим профилем (13, 15. 16, 20, 21, 23, 42, 43, 52, 75). Методика позволяет количественно описать статистические границы, характеризующие каждый класс образца в терминах их метаболических профилей, и отличить образцы, не принадлежащие ни к одному из классов. Образец может принадлежать как к единственному классу, так и ко многим классам. Построив исчерпывающий ряд моделей, можно предусмотреть классификацию для широкого диапазона биообъектов. В настоящее время, благодаря возможностям такого подхода, установлены биомаркеры токсических повреждений, вызванных рядом ксенобиотиков, генетических повреждений, нежелательных побочных эффектов лекарственных препаратов и пестицидов, фенотипов (метаботипов), сформированных в результате взаимодействия генотипов с внешней средой.

Как уже отмечалось, метаболическое профилирование не связано непосредственно с изучением метаболизма ксенобиотиков. Однако метаболические исследования применялись и для объяснения влияния первичных и вторичных продуктов метаболизма ксенобиотиков на человека. Например, при ЯМР-исследовании мочи и плазмы крови были обнаружены метаболиты, образование которых связано с токсическим действием хлорида ртути, гидразина и ряда антибиотиков.

С помощью ЯМР-анализа были расшифрованы и уточнены многие метаболические процессы — от биосинтеза коферментов в микробах и регуляции метаболизма глюкозы у млекопитающих до реакций переноса метильной группы в структуре метаболита при токсических поражениях печени (рис. 9).

Рис. 9. 800 МГц 1H ЯМР-спектры типичного образца мочи человека.

Последовательные горизонтальные и вертикальные расширения спектра иллюстрируют сложность биохимического профиля. Вертикальная стрелка указывает на незначительный пик от аксиальной метильной группы желчной кислоты. Методом 1H ЯМР-спектрометрии можно обнаружить очень тонкие изменения в минорных метаболитах («Clark's Analysis of Drugs and Poisons», London, 2004).

Следует отметить, что ни одним из инструментальных методов исследования нельзя полностью показать всю сложность структуры метаболома у прокариот или эукариот. Это зависит от генетической изменчивости, тканевого и клеточного разнообразия, качества питания и огромного числа разнообразных молекул, которые включает в себя метаболом. Аналитики всегда занимались специфическими исследованиями индивидуальных видов (например, гистамин или АТФ) или классов молекул (например, аминокислоты или нуклеотиды), однако цель метабономики состоит в установлении полного набора малых молекул, присутствующих в биологической жидкости. В конце 2002 г. в базе данных КЕГГ (KEGG) насчитывалось более 10.000 соединений, 8.000 из которых имели молекулярную массу 30-1.500 Д. Многие соединения молекулярной массой 1.000-1.500 Д являются пептидами и конъюгатами кофермента А. Среди соединений молекулярной массой менее 1.500 Д большинство находятся в интервале 100-600 Д. К тому же, многие макромолекулярные структуры (например, мембраны) состоят из плотно, но динамично связанных небольших молекул. Поэтому задача аналитика состоит в том, чтобы доступными методами определить качественные изменения метаболитов, различающихся молекулярной массой, поляризацией, зарядом, устойчивостью. Еще одна сложность заключается в неравномерном распределении метаболитов различных веществ (например, глюкозы или стероидных гормонов) в биологических жидкостях и тканях. Поэтому популярность комбинированного метода ВЭЖХ-ЯМР при идентификации компонентов биожидкостей растет. Миниатюризация аппаратуры и возможности измерения пикомолярных количеств образца привлекают к себе большое внимание. Уже существуют экспериментальные системы для ВЭЖХ-ЯМР, соединенные с Фурье-преобразователем, ИК- и масс-спектрометрометрами. В будущем такие системы дадут возможность анализировать смеси добавок полимера или идентифицировать in vivo неизвестные компоненты, не изолируя их в индивидуальном виде.

Определение компонентов в сложных биоматрицах проводят в объединенных аналитических системах ВЭЖХ-ЯМР-МС, что дает возможность быстрой полной и надежной молекулярной идентификации. Схема ВЭЖХ-ЯМР-МС приведена на рис. 10.

Рис. 10. Схема оборудования для ВЭЖХ-ЯМР-МС исследования.

Толстые линии — движение потока; тонкие линии — электронный контроль и сигналы данных.

Длина и направление капиллярных трубок к этим спектрометрам могут быть отрегулированы так, чтобы или ЯМР-спектрометр, или масс-спектрометр сначала обнаружил элюат. Например, масс-спектрометр может помешать первоначальной идентификации 19F ЯМР-сигнала, идущего от определяемого образца. Поэтому ЯМР-спектрометр размещают перед масс-спектрометром.

На сегодня известны несколько методик, позволяющих использовать системы ВЭЖХ-ЯМР (82). Самая простая из них — обнаружение веществ по ЯМР-спектрам в режиме реального времени, как непрерывного потока хроматографических пиков элюата. Однако практически для обнаружения используются только 1H или 19F ЯМР-спектрометры.

Другой распространенный подход — сохранение частей элюата в капиллярных петлях для более позднего автономного изучения ЯМР-спектра (выбор пика). Кроме того, поток может быть приостановлен в коротких интервалах времени при пропускании его через ячейку ЯМР («разрезание» времени) аналогично использованию диодного множества УФ-датчика. Такая методика позволяет получить спектры от различных частей пика. «Разрезание» времени особенно полезно, если разделение происходит недостаточно и трудно определить времена удерживания. В современных приборах возможен полностью автоматизированный анализ при контроле программного обеспечения. Автоматизированный анализ может быть приостановлен в любое время с возвратом к «ручному» управлению.

С помощью системы ВЭЖХ-ЯМР-МС можно получить ценные масс-спектрометрические данные, которые в дальнейшем будут использованы для оптимального выбора пиков и их ЯМР-анализа. Так, например, можно установить фрагменты гидроксилированного метаболита или глюкуронида токсиканта. ЯМР-спектры биологических образцов (биожидкостей) чрезвычайно сложны и содержат много тысяч резонансных поглощений. Получить максимальную информацию от сложных спектров можно при использовании машинных методов с использованием специальных математических приемов — мультивариантной статистики.

Предел обнаружения и количественный анализ вещества зависят как от природы определяемых молекул, так и от класса технической сложности оборудования (например, разрешения соответствующего ЯМР-спектрометра). Интеграл резонанса в ЯМР прямо пропорционален количеству соединений в ЯМР-образце. Пределы обнаружения современных ЯМР-спектрометров ограничивают определение метаболитами с концентрацией ≥ 0,1 мМ-6. Предел обнаружения в методе ВЭЖХ-МС зависит от концентрации, степени ионизации компонента и технологического приема исследования иона. С помощью современных систем можно обнаружить субпикомолярные количества молекул в 1 мкл. образцов. Фактором, ограничивающим обнаружение ионов, является ионизация молекул в водном растворе. Степень ионизации для определенной молекулы различается в разных образцах. На исследуемый ион влияют солевые и буферные растворы, например ион натрия, быстро образует аддукт с кислородом, вызывая сдвиг в молекулярном ионе от М + Н (М + 1) до М + Na (М + 23). Ионизация молекул может быть подавлена другими ионами при одновременном присутствии. Все это должно быть проконтролировано и учтено при анализе.

Сложная структурная организация

клеток и тканей представляет большие трудности при исследованиях метаболитов. Схема проведения метаболических исследований представлена на рис. 11. Многие типы образцов требуют разрушения клеток и тканей, центрифугирования, экстракции и концентрирования (59).

Рис. 11. Общая схема проведения метаболических исследований

Например, для исследования образцов крови новорожденных вначале проводят экстракцию крови с фильтровальной бумаги. Экстракт можно либо сразу исследовать в масс-спектрометре, либо сначала хроматографировать, а затем проводить МС-анализ (13). Некоторые стадии могут быть укорочены в зависимости от типа образца и метода анализа. При исследовании биологических жидкостей приготовление образца может включать добавление дейтерированного буфера и внутренних стандартов для ЯМР. Фильтрованные жидкости также могут прямо исследоваться в масс-спектрометре. В любом случае, полное качественное и количественное определение метаболитов в каком бы то ни было образце будет требовать одновременного применения различных методов. Поэтому использование той или иной аппаратуры для метаболических исследований зависит от цели исследования, в частности, от того, является ли задачей исследования полная характеристика метаболической структуры данного образца или сравнительный метабономический анализ. В первом случае оптимальным является использование наиболее чувствительных спектрометров сильного магнитного поля и особых методик. В ряде случаев для определения метаболитов с низким содержанием в пробе может потребоваться комбинированный метод ВЭЖХ-ЯМР. Сравнительные метабономические исследования различных образцов, в которых концентрации солей, белков, величина рН и другие параметры варьируют в ограниченной степени, могут проводиться с помощью спектрометра низкого поля, однако при этом увеличивается общее время исследования. Например, при 300 МГц общее время исследования для достижения нужного уровня чувствительности увеличивается в 4,6 раза по сравнению с исследованием, проведенным при 500 МГц.

Кроме исследований мочи и плазмы крови, метаболические анализы включают также исследование содержимого клетки. Используются различные протоколы, зависящие, главным образом, от того, направлен анализ на гидрофильные компоненты клетки или липофильные. Надежные результаты получают после твердофазной экстракции аналитов. При этом повышается чувствительность при определении нуклеозидов, нуклеиновых оснований и монофосфатов нуклеозидов, но количественные характеристики триглицеридов занижены (ниже контрольных значений).

Метод ЯМР позволяет добиваться почти идеального спектрального разделения компонентов, поэтому анализ смеси, как правило, не требует дополнительного хроматографирования. Однако если число компонентов очень большое или резонансные пики соответствуют больше метаболитам, чем основным компонентам, то используют комбинированный метод ВЭЖХ-ЯМР или ВЭЖХ-ЯМР-МС (82). Изо всех хроматографических детекторов масс-спектрометры в настоящее время имеют наибольшее значение для полного метаболического анализа. Это происходит благодаря быстрому развитию масс-спектральных технологий в последнее десятилетие. Появление электроспрейной ионизации расширило возможности МС при биологических исследованиях; масс-спектры крупных и высокополярных молекул теперь можно обнаруживать либо прямо из биологических образцов, либо после разделения, например, с помощью ВЭЖХ. К тому же, инструментальные методы становятся менее объемными, а исследования с применением компьютерных программ открывают новые возможности. Эффективность масс-спектрального детектирования при метаболических исследованиях связана не только с высокой чувствительностью метода, но и с возможностью разделения метаболитов с помощью масс-спектрометра в соответствии с молекулярной массой при минимальном разрешении 1 а.е.м. Таким образом, в зависимости от разрешения конкретного масс-анализатора, количество полос (пиков) масс-спектра может варьироваться в очень широких пределах. Наложение пиков в масс-спектрах происходит, если анализируемые соединения имеют одинаковую молекулярную массу и одинаковую молекулярную формулу (например, различные гексозы). Такие соединения должны быть либо разделены хроматографически перед МС-анализом, либо подвергнуты тандемной МС-МС. Сегодня существует много типов масс-спектрометров, применяемых для метаболических исследований.

Методы ионизации API и ESI используются для перевода полярных метаболитов в масс-спектрометре из водных растворов в ионы газовой фазы. Как правило, многие гетероатомы и функциональные группы (например, COOH и NH2), содержащиеся в молекуле, склонны к ионизации с помощью API. Однако API не позволяет произвести полную ионизацию всех типов биомолекул. Ионизацию можно увеличить при добавлении некоторых летучих буферов к растворителю (например, уксусная, муравьиная, трифторуксусная кислоты, ацетат аммония). ESI-МС — самый распространенный метод исследования биомолекул, который можно использовать с различными масс-анализаторами: такими, как квадруполь, ToF (времяпролетный) или резонанс Фурье-преобразователь — FT. Важно, что ToF обеспечивает быстрое обнаружение спектров, высокую точность и разрешение. Однако метод ToF-МС имеет некоторые ограничения предела обнаружения, зависящие от природы соединений.

Квадрупольные инструментальные методы, благодаря их способности мониторить ионы, используя тандемную МС (МС-МС или МС2), на сегодняшний день являются золотым стандартом чувствительности и предела обнаружения (82).

Метод FT-MС имеет высокую разрешающую способность и дает четкие пики. Однако он сложен и применяется редко; для того, чтобы FT-МС стал методом выбора при метаболических исследованиях, понадобится время.

Для определения метаболитов, обладающих окислительно-восстановительными свойствами, в биологических образцах (таких, как нейромедиаторы, флавоноиды в плазме, эндогенные антиоксиданты в плазме и метаболомы митохондрий) используются способы высокочувствительного электрохимического детектирования в ВЭЖХ. В зависимости от структуры и природы конкретного метаболита чувствительность метода находится в пределах 5-10 пикограммов.

Эффективность работы систем ВЭЖХ-ЯМР-МС можно подтвердить примером. В нескольких крупных медицинских центрах США был проведен анализ 62 метаболитов мочи, включающих органические кислоты и аминокислоты, у пациентов, отобранных в группы по определенным показателям. Метод дал количественные данные (с отклонениями < 15 %) для большинства метаболитов и достоверно идентифицировал 105 из 108 больных с наследственными метаболическими заболеваниями.

Метаболические маркеры.

С помощью метаболических маркеров можно провести сравнительные количественные анализы изменений специфических метаболитов плазмы и мочи при действии токсикантов (12, 13, 50, 59). Имеются сведения о некоторых метаболических маркерах, идентифицированных при исследовании мочи и других биологических жидкостей с помощью ЯМР. Например, при изучении в эксперименте токсичности HgCl2 (рис. 12) наблюдают значительное повышение содержания янтарной, молочной и уксусной кислот).

а) — контроль;

б) — через 24 часа после введения HgCl2 в дозе 1 мг/кг;

в) — через 24 часа после введения HgCl2 в дозе 2 мг/кг.

Кроме того, в образцах мочи обнаружена повышенная концентрация этанола. Полагают, что такая концентрация этанола является следствием снижения активации алкогольдегидрогеназы  Дифференцирующими метаболитами для определения степени токсического эффекта ртути являются валин, таурин, глюкоза и оксид триметиламина (ТМАО). Последний является общим биомаркером почечной токсичности и идентифицируется при действии других нефротоксикантов (рис. 13).

Нижний спектр — преддозовый (суточный) контроль;

другие спектры — через 8-48 час. соответственно после введения полипропиленимина.

Важно отметить влияние кишечной микрофлоры на метаболические процессы  Микробный метаболизм очень изменчив. Кишечные бактерии обладают изменчивой восприимчивостью к лекарствам и токсикантам. Участие кишечной микрофлоры в синтезе метаболитов мочи зависит от их природы. Как указано выше, ТМАО является общим биомаркером почечной токсичности. Кишечные бактерии играют большую роль в метаболизме метиламина. Образование триметиламина (ТМА) из холина происходит, главным образом, с помощью кишечных бактерий, тогда как последующее окисление в ТМАО осуществляется преимущественно в печени. Образование ТМАО является примером сложных метаболических взаимодействий, которые должны рассматриваться с целью адекватной оценки результатов метаболомических анализов. У пациентов с хронической почечной недостаточностью часто происходит чрезмерно быстрый рост кишечных бактерий. Это способствует пониженному пищевому статусу больных, особенно нуждающихся в постоянном диализе. По данным исследователей, в организме повышаются уровни диметиламина (ДМА) и его канцерогенного метаболита — нитрозодиметиламина (НДМА). Следовательно, повышенный уровень ДМА и НДМА в моче может служить маркером действия почечного токсиканта. Однако различные почечные токсиканты по-разному влияют на рост кишечных бактерий, поэтому важно знать, как изучаемое соединение реагирует с кишечной флорой. Пока затруднительно ответить на вопрос, каким образом сопоставить уровень ДМА, как маркера метаболической активности кишечных бактерий, и уровень ДМА, зависящий от поступления холина из пищи и других источников, которые могут служить предшественниками синтеза метиламина.

При депрессии и других психических заболеваниях в моче обнаруживают фенилацетат — продукт катаболизма фенилаланина и фенилэтиламина. Уровень фенилацетата и конъюгатов фенилацетата может изменяться под действием оральных антибиотиков, что подчеркивает роль кишечных бактерий в метаболизме ксенобиотиков.

Несмотря на многие вопросы, требующие ответа исследователей, и несовершенство аналитических технологий, метабономический анализ произвел революционный прорыв в медицине, и в частности в токсикологии и фармакологии.

Еще одним примером служит идентификация пироглутамата (5-оксопролина) как маркера токсического действия высоких доз парацетамола (N-ацетил-п-аминофенола). Накопление пироглутамата несомненно связано с метаболизмом серосодержащих аминокислот, так как процесс может быть остановлен введением метионина, который опосредованно используется организмом как сульфатный и цистеиновый конъюгат парацетамола. В 1Н ЯМР-спектре мочи были обнаружены резонансные характеристики обоих конъюгатов, а также парацетамола глюкуронида. Таким образом, было установлено, что 5-оксопролинурия является следствием недостаточного количества серосодержащих аминокислот. Наблюдения показывают, что 5-оксопролинурия также может быть биомаркером других химических агентов, которые снижают содержание серосодержащих аминокислот.

Недавние исследования с помощью системы ВЭЖХ-ЯМР (48) образцов мочи людей, подвергавшихся хроническому производственному отравлению гептилом (ракетное топливо) в течение нескольких месяцев, показали повышение уровня 2-аминоадипата, β-аланина, цитруллина, N-ά-ацетилцитруллина и аргининсукцината, что можно считать обнаружением биомаркеров токсического эффекта несимметричного диметилгидразина (рис. 14).

Образец исследовали через 56 час. после последней интоксикации гептилом или диметилгидразином (пояснение в тексте).

Малотоксичные вещества могут вызывать временные нарушения метаболизма без нанесения большого вреда тканям и органам, но прибор зафиксирует метаболический профиль, отличающийся от принятой нормы. Поэтому интерпретировать результаты анализа необходимо с учетом наиболее полной информации о пациенте или потерпевшем.

В ближайшее время, благодаря новым технологиям, число уникальных биомаркеров будет гораздо больше.

Целью метаболических анализов является определение концентраций основных метаболитов, однако не менее важным и вполне информативным может быть изучение того или иного метаболита в условиях конкретного организма in vivo. Такие анализы включают использование меченных изотопами прекурсоров и определенных метаболитов.

Соединения, сходные по структуре, но имеющие разный состав изотопов, называются изотопомерами. Использование стабильного изотопа 13С, принимая во внимание его распространенность в природе (1,1 %), обеспечивает надежность результатов анализа. Методом ЯМР-спектрометрии можно определить расположение изотопа в изучаемом соединении, так как каждый изотопомер показывает определенный ЯМР-спектр. Определение состава изотопомера возможно с помощью как прямой одномерной, так и двухмерной 13С ЯМР-спектрометрии. HSQC-спектрометрия является более чувствительным и доступным для интерпретации результатов методом.

Для изучения метаболизма дейтерированных субстратов применяют 2Н ЯМР. Положительная сторона этого подхода заключается в относительной легкости проведения исследований и низкого распространения дейтерия в природе по сравнению, например, с 13С. Метод 2Н ЯМР может использоваться для анализа печеночного метаболизма.

При исследовании метаболизма L- и D-[метил—2Н3]метионина ([метил—D3]метионина) с помощью 2Н ЯМР (D ЯМР) in vivo можно проследить биотрансформацию того или иного изомера, используя специальную поверхностную спираль, помещенную на печень анестезированных крыс. При исследовании L-метионина была обнаружена реакция трансметилирования, приводящая к образованию [метил—D3]саркозина (рис. 15), что позволяет определить активность метионинаденозилтрансферазы и глицин-N-метилтрансферазы.

Рис. 15. 500 Мгц 2Н ЯМР-спектры биоптатов печени крыс.

HDO— дейтерированная вода; CHD —дейтерированная группа СН2.

С течением времени некоторые другие метаболиты также становятся дейтерированными из-за действия ферментов, вовлеченных в процессы метаболизма. Одни из дейтерированных саркозинов окисляются в митохондриях с помощью саркозиндегидрогеназы, в конечном счете превращаясь в дейтерированную воду, однако некоторое количество может экскретироваться.

Интересно, что аналогичные исследования, в которых использован прекурсор дейтерированного D-метионина, дали, по сути, такие же результаты, показывающие быстрое превращение D- в L-изомер. Сравнение метаболизма L- и D- [метил—D3]метионина показало, что результаты могут меняться под воздействием бензоата натрия, ингибитора D-аминооксидазы. Преобразование D-метионина в L-метионин, в котором участвует этот фермент, сопровождается обратным аминированием, катализирующимся ферментом глутаминазой II. Применяя такую технологию, можно исследовать эффекты специфических химических веществ в метаболических путях. Было отмечено уменьшение количества L-метионина при введении бензоатов, что, возможно, связано со снижением уровня глицина, так как последний используется в этом случае для образования гиппурата из бензоата. Снижение уровня глицина уменьшает его активность в реакции образования глицин-N-метилтрансферазы, что опосредованно ведет к уменьшению количества L-метионина.

Обнаруженные in vivo с использованием метода поверхностной спирали дейтерированные метаболиты печени, по-видимому, были определены и в моче с помощью 2Н ЯМР.

Классический аналитический подход к измерению метаболического уровня в биологических системах с использованием внутренних стандартов и построением калибровочных графиков практически неприменим для полных исследований сложных метаболомов. Для автоматического анализа данных при определении метаболических характеристик были разработаны специальные опознавательные компьютерные программы, коррелирующие результаты исследований многоаспектного набора данных (например, значения хроматографических времен удерживания, интенсивности масс- и ЯМР-спектров). Масштабы сокращения времени получения массива данных огромны. С помощью метода ВЭЖХ-ЯМР-МС- TоF в течение 20 мин. (со скоростью 5 спектров в секунду) можно создать 6.000 характерных МС- и ЯМР-спектров, каждый из которых включает более 50.000 точек. Задача состоит в том, чтобы выделить все реальные масс-спектральные и ЯМР- характеристики для более чем 1.000 потенциальных метаболитов в каждой хроматограмме. Одним из способов визуализации и анализа данных является создание контурных графиков, на осях которых указаны аналитические сигналы методов. Различия в контурах от образца к образцу отражают изменения в метаболических путях. При этом необходимо иметь информацию о том, какому (острому или хроническому) воздействию токсиканта подвергся обследуемый. В некоторых случаях краткосрочные изменения метаболизма при остром отравлении могут быть противоположны этим же изменениям, наблюдаемым у пациента при длительном воздействии токсиканта.

В клинической диагностике метаболических изменений применение комплекса ВЭЖХ-ЯМР-МС позволило определить липопротеины плазмы крови. Метод ЯМР-спектрометрии позволил получить индивидуальную характеристику каждого определенного липопротеина согласно их разделению на липопротеины высокой плотности, липопротеины низкой плотности (ЛПНП) и липопротеины очень низкой плоскости, имеющих очень небольшое различие между собой, которое заключается в разном диаметре фосфолипидного слоя в оболочках липопротеинов  Исследования показали, что люди с повышенным содержанием триглицеридов имеют высокое содержание липопротеинов. Богатые триглециридами липопротеины индуцируют реакции продукции ЛПНП ненормальных размеров и увеличивают содержание холестерина. Традиционными методами исследования холестерина невозможно точно определить количество ненормальных ЛПНП и сопутствующий риск коронарных заболеваний. С помощью ЯМР-спектроскопии можно точно определить класс липопротеинов, что дает возможность диагностировать и успешно лечить сердечно-сосудистые заболевания. Несмотря на то, что эти исследования проводились с клинической целью, с их помощью можно определить повреждающее действие токсикантов, оказывающих влияние на метаболизм липопротеинов, или мобилизацию гликогена, стадии глюкогенеза и другие процессы, происходящие в организме в режиме реального времени.

Заключение

- Генетическая токсикология оценивает результаты воздействия химических и физических агентов на генетический материал и генетические процессы в живых клетках.

- Процессами метаболизма клеток, их делением и дифференцировкой управляет сложная сеть молекулярных взаимодействий, определяющая уровни экспрессии различных генов, информацию о которых можно получить с помощью биочипов.

- Изучение динамики метаболических процессов, происходящих в клетке, и природы метаболитов являются частью исследования структурной организации сетей метаболических потоков, основой выявления принципов их регуляции и определения регуляторных инвариантов, обеспечивающих гомеостаз в сетях метаболических потоков.

- Новые высокопроизводительные технологии, применяемые в генетической токсикологии, позволяют идентифицировать многие мутагены, оценивать риск действия различных токсикантов и развития побочных эффектов лекарственной терапии в зависимости от индивидуального гено- и фенотипа.

- Масс-спектрометрический анализ полиморфизма ДНК — эффективный способ определения полиморфизма с очень низкой стоимостью одного определения и высокой производительностью. Возможность мультиплексного определения мутаций или замен позволяет определять до 1.000.000 точек в день.

- Технология метаболомики и метабономики и использование аналитических систем ВЭЖХ-МС-ЯМР или ВЭЖХ-МС 2–ЯМР (или других, например ВЭЖХ-МС- ЯМР- ИСП*-МС) позволяет определять профили метаболических заболеваний или экологических нарушений до того, как у человека возникнут соответствующие симптомы. Определение метаболома даст возможность полнее понять интерактивную природу клеточных реакций на химические агенты. В настоящее время разрабатывают «белковые» микрочипы для определения протеома.

- Эффективность (и токсичность) медикаментозного лечения зависит от многих факторов, в первую очередь генетических, а также кишечной флоры. Многие микроорганизмы синтезируют соединения, которые активируют ферменты, ответственные за процессы детоксикации в печени, а ряд метаболитов микробного происхождения является непременным участником обмена веществ у человека.

________________________

*) ИСП-МС – масс-спектрометрия с индуктивно-связанной плазмой; метод одновременного определения многих элементов (до 80) в одном биообразце