Метаболомика и метабономика - современные технологии токсилогических исследований(часть 1). - BioinforMatix.ru - портал по биоинформатике, имейджингу и биософту

Метаболомика и метабономика - современные технологии токсилогических исследований(часть 1).

Печать E-mail
Автор Н.И. Калетина   
14.10.2008 г.

Плоть человека — свиток, на котором
Отмечены все даты бытия...

 (Максимилиан Волошин)

 

Значительная часть населения России (примерно 75 %) постоянно проживает в условиях загрязнения окружающей среды, обусловленного, в основном, выбросами промышленных предприятий и автотранспорта, особенно в крупных городах и регионах с высокоразвитой индустрией. На подавляющем большинстве территорий основными загрязнителями являются органические вещества (полиароматические углеводороды, фенол, формальдегид и др.), тяжелые металлы, оксиды азота и углерода, диоксид серы.

Так, в России порядка 14 млн. человек подвергаются воздействию бензапирена. Более 5 млн. проживают на территориях с повышенным содержанием в воздухе оксида азота (IV), сероуглерода, формальдегида и оксида углерода (II). В атмосферном воздухе городов России, по сравнению с городами Европы и США, регистрируются более высокие концентрации аммиака, бензапирена, стирола, фенола, более низкие — оксида серы (IV),   а  содержание оксида азота (IV) и формальдегида такое же, как в европейских странах (3). Для источников питьевого водоснабжения главными загрязнителями являются токсичные вещества, состав которых во многом определяется региональными особенностями развития производства. Значительную опасность для здоровья населения представляет загрязнение почвы соединениями металлов.

Обязательная регистрация всех вновь поступающих в обращение химических веществ отечественного и зарубежного производства в Российском регистре потенциально опасных химических и биологических веществ (www.regchem.msk.ru) показывает, что их число на начало 2006 г. составляет более 2.500 наименований.

«Внешние факторы сами по себе не создают в организме специфических изменений. Но последние возникнут с неизбежностью, когда внешний фактор найдет себе специфическое, то есть адекватное, функциональное и морфологическое, преломление. Именно этим путем в организме возникли и закреплялись те или иные структуры и приспособительные устройства», — писал один из основоположников русской школы патологической анатомии академик И.В. Давыдовский (1962 г.). Организм — сложная динамическая полилигандная и полиметаллическая система, для функционирования которой необходимо поддержание металлолигандного гомеостаза (МЛГ). Токсиканты — химические факторы нарушения гомеостаза. Изменения экспрессии генов далеко не всегда являются результатом непосредственного взаимодействия токсикантов и ДНК: гораздо чаще это — взаимодействие химических и физических агентов с белками (1, 29). Модификации белков влияют на белковые сигнальные цепи и факторы транскрипции, регулирующие экспрессию генов. Внешние факторы, изменяющие белковые функции, таким образом, сказываются на экспрессии генов.

Современные технологии дали возможность проводить одновременно анализ экспрессии тысяч генов и облегчили изучение клеток как систем, в которых общая экспрессия всех генов определяет состояние клетки (7, 8, 30). Конечно, часто предполагается, что изменения экспрессии генов отражают в дальнейшем изменения и в протеомах. Следует иметь в виду, что любой белковый продукт одного гена может существовать в многообразных формах благодаря постмодификационным видоизменениям, существованию мутаций и образованию цепей. Таким образом, проявления внезапных реакций могут наблюдаться только на уровне протеома. Генные исследования и протеомика комплиментарны в том смысле, что гены определяют образование специфических протеинов.

Понятие о риске объединяет две характеристики. С одной стороны, это понятие конкретно: риск от воздействия какого-то фактора или риск для какой-либо возрастной группы, и т. д. С другой стороны, понятие имеет вероятностный характер: каковы последствия реализации риска, как они соотносятся с другими рисками и т. п. Оценка риска — сложный процесс, направленный на установление, оценку и предсказание возможности причинения вреда здоровью человека и обществу в целом, подвергнутому действию химикатов и их побочных продуктов или метаболитов (рис. 1).

Image

Рис. 1. Взаимосвязь неблагоприятного влияния токсикантов на здоровье человека, их идентификации и оценки риска причинения возможного вреда.

Оценка риска учитывает несколько основных факторов. Прежде всего, это опасность, вероятность экспозиции, соотношение «доза - ответ», восприимчивость организма.

Токсикологическая оценка опирается на многофакторную и обязательно количественную информацию о характере и действии химических веществ на организм. Система «популяция - токсикант» является открытой неавтономной динамической системой, эволюционирующей во времени. Открытость системы означает наличие потоков биомассы и токсикантов, неавтономность — зависимость потоков от времени. Для характеристики риска применяются комбинированные методы определения опасности, зависимости «доза – ответ» и оценки воздействия. При этом экстраполируют (распространяют выводы, полученные из наблюдения над одной частью явления, на другую его часть) воздействие высокой дозы токсиканта на меньшую дозу, проявление эффекта воздействия токсиканта у животных — на человека, используя фактор неопределенности.

Достижения медицинской науки привели к внедрению огромного количества новых лекарственных средств (ЛС), но и проблем безопасности их применения становится все больше. Например, в мультицентровых клинических испытаниях «MERIT-HF», «COMET», «OASIS», «ATLAS», «PREVENTMARS», «FATS», «CLAPT», «LRT», «EXCEL» и ряде других сообщается о значительной распространенности нежелательных реакций на ЛС различных групп. Часто их развитие связано с высокой концентрацией ЛС в плазме крови вследствие изменения свойств системы биотрансформации и транспортеров (81, 82). К настоящему времени уже многое известно о полиморфизме генов, кодирующих ферменты биотрансформации и транспортеров. В доклинических исследованиях всех новых ЛС, согласно концепции доказательной медицины, необходимо учитывать их влияние на состояние системы биотрансформации и транспортеров. При проведении клинических испытаний отбор пациентов должен проводиться с учетом генотипа изоферментов метаболизма. США и страны ЕС при проведении экспертизы всех новых лекарств в обязательном порядке выявляют основные факторы, влияющие на ферменты метаболизма, для чего проводят генотипирование пациентов. В этих странах врачи постоянно используют результаты новых фармакогенетических исследований.

Как показывает анализ литературы, для клинического применения уже доступны около 150-200 генетических тестов. Их широко применяют в различных центрах США и стран Западной Европы, особенно во Франции, Великобритании и ФРГ. Во Франции, например, разработана и используется в медицинской практике система «SESAM». Она включает компьютерную интерпретацию результатов генетического тестирования,  а  также данные биохимических, серологических и иммунологических анализов. В ходе ее выполнения используют свыше 80 тестов, которые обрабатываются при помощи специальной компьютерной программы «РРМА». Последняя включает в себя собственно экспертную оценку, разделы обучения и тренинга для практикующих врачей, медицинское консультирование и справочник для населения. Основной упор в программе сделан на интерпретацию результатов различных генетических тестов, в первую очередь — на изучение состояния генов системы детоксикации, ответственных за чувствительность человека к различным внешним воздействиям (особенно к химическим препаратам, лекарствам, другим ксенобиотикам).

Современная токсикология и оценка риска являются важнейшими взаимодействующими элементами систем обеспечения химической безопасности, социально-гигиенического и экологического мониторинга. В России аналогичных программ пока нет,  а  число фармакогенетических лабораторий недостаточно. Однако различные предиктивные генетические тесты проводятся в специализированных лабораториях и центрах Москвы, Санкт-Петербурга, Новосибирска, Томска и Уфы.

Необходимость внедрения в широкую медицинскую и экспертную практику методов генотипирования ферментов метаболизма лекарств отражено в приказе Минздрава России от 22.10.03 No. 494 «О совершенствовании деятельности врачей — клинических фармакологов». Широкое применение фармакогенетических тестов и технологии биочипирования поможет выявлению серий мутантных аллелей, ответственных за изменение ответа организма (рис. 2).

Image

 

Рис. 2. Схема фармакогенетических исследований (в частности, токсикогенетических), служащих молекулярной основой обеспечения химической безопасности (В.С. Баранов, 2003).

В последние годы во всех развитых странах значительно возросли требования к объему и качеству токсикогенетической информации. Это определяет важность создания системы надежных экспресс-методов исследований и позволит в ближайшие годы выработать алгоритмы критериев необходимости и достаточности генетических исследований при изучении механизма действия различных токсикантов (31-33, 73).

База данных по токсикогеническим вопросам лекарственной токсикологии представлена в приложении.

В 1998 г. N.G. Anderson писал: «ДНК — это на самом деле не нижняя точка: любой современный учебник биологии объясняет, что протеины определяют активную жизнь клетки, в то время как нуклеиновые кислоты представляют собой только план этой активности».

Новые технологии, в том числе нанотехнологии, способны произвести революцию в медицине, введя в нее новые методы диагностики и лечения, основанные на знании структуры генома человека. Проект «Геном человека» начат в 1990 г. Первая (черновая) версия последовательности нуклеотидов была закончена в 2000 г. («International Human Genome Sequencing Consortium», Venter et al., 2001). Конечная версия, которая больше не будет совершенствоваться (названная «Build 35»), — закончена в 2004 г. В результате проделанной работы вышли две статьи: Вентера — в журнале «Science» и Лэндера — лидера мирового сообщества — в журнале «Nature» (500 соавторов в 2 статьях!).

Число генов у человека составляет 20.000-25.000, что немного меньше, чем предсказывалось раньше (от 30.000 до 40.000 генов). Последняя версия последовательности содержит 2,85 млрд. пар нуклеотидов с 341 брешью, т.е. в этих местах по каким-то причинам секвентировать геномную ДНК не удалось. Аккуратность секвенса в конечной версии — 1 ошибка на 100 тыс. позиций подряд. Еще точнее секвентировать весь геном уже никто не будет. Наиболее значимое научное достижение последних лет — это картирование генома человека, в результате чего созданы атлас последовательности нуклеотидов геномной ДНК человека (референтная последовательность) и базы данных:

- о последовательности нуклеотидов транскрибируемых участков ДНК (EST Database, EST — Expressed Sequence Tags);

- о положении и содержании отличий (полиморфизмов, т.е. нуклеотидных замен) других известных последовательностей ДНК человека от референтной последовательности (SNP database, SNP — Single Nucleotide Polymorphism).

Отдельный ген занимает конкретное место (локус) в цепочке ДНК в хромосоме и всегда находится в хромосомах определенного типа. Гены представляют индивидуальные коды для формирования белков в организме. Первоначальная теория о том, что один ген отвечает за синтез одного белка, была признана неверной. Один ген может отвечать за синтез ряда белков или через альтернативный сплайсинг*, или через посттрансляционные модификации.

Расшифровка генома человека привела к возникновению ряда научных направлений принципиально нового характера, получивших собирательное название «постгеномные технологии». К ним относятся: геномика, транскриптомика, протеомика и метаболомика (совокупность технологических и методических приемов изучения живых систем), биоинформатика (средство обеспечения информационно-вычислительной поддержки исследований), нанобиотехнология (способ практического внедрения полученных результатов) и молекулярная биология как основополагающая наука о жизни (51-52).

Протеомика — направление молекулярной биологии, занимающееся сравнительным изучением клеточных протеомов (наборов белков данной клетки в данной фазе ее развития в определенный момент времени), — выросла из геномики. Перед протеомикой стоит грандиозная задача: определить функциональную роль отдельных белков путем экспериментального сопоставления их качественного и количественного состава в клетке на разных стадиях и в разных состояниях ее развития, установить взаимосвязи между структурой белка и его функциями. По приблизительным подсчетам, количество возможных человеческих белков лежит между 1 и 100.000.000. Протеины, конечно, могут взаимодействовать друг с другом, и число таких взаимодействий не поддается подсчету. Протеом, по аналогии с геномом (совокупность всех человеческих генов), — это сумма всех протеиновых молекул, сформированных в клетке на определенный момент времени. Геном «говорит», какие процессы могут теоретически протекать внутри данной клетки,  а  протеом, судя по имеющимся протеинам, «подсказывает», что действительно происходит здесь и сейчас. Протеины определяют активную жизнь клетки, в то время как нуклеиновые кислоты представляют собой только план этой активности (рис. 3). Протеом — это «опись имущества» клетки по состоянию на данную минуту или моментальное фото, запечатлевшее одно из мгновений в ее жизни. Протеом постоянно меняется, поскольку на состав белковых молекул влияют самые различные факторы: выбор питательных веществ и приток кислорода, перенесенный стресс и принятые лекарства. Организм непрерывно реагирует на состояние окружающей среды, пытаясь сохранить физиологическое равновесие. Внешние факторы, наоборот, стремятся нарушить его. Это связано с синтезом, преобразованием и разложением белков,  а  реальную возможность протекания таких процессов, их направление и скорость часто определяют ионы металлов.

___________________________________

*) Сплайсинг (сшивание, сращивание) — процесс вырезания интронов («ненужных» участков молекулы РНК) и сращивания экзонов (участков ДНК, несущих информацию о строении белка) при образовании иРНК; осуществляется специальными ферментами.

Image

 

Рис. 3. Взаимосвязь геномики и протеомики.

Динамичная модификация белков — неотъемлемый контрольный механизм в живых системах. Различные эндогенные процессы, такие, как фосфорилирование, ацетилирование, гликозилирование и убиквитилирование (конъюгация белка-мишени и белка убиквитина), регулируют многие белковые функции, взаимодействия и превращения белков. Повреждающие факторы могут влиять на модификационный статус белков несколькими путями (рис. 4). Некоторые токсиканты биотрансформируются в активные электрофилы, которые считаются причинами модификаций. Другие токсиканты могут привести к формированию оксидантов и эндогенных электрофилов, которые могут также модифицировать белки. Электрофильные взаимодействия, по-видимому, играют существенную роль в механизмах токсичности. Модификации эндогенных регуляторных белков весьма чувствительны к изменениям, вызванным факторами окружающей среды.

Image

 

Рис. 4. Взаимосвязь между действием токсикантов и модификацией белков.

Часто можно проследить зависимость между изменениями протеома и определенным патологическим состоянием. Отношение между геномикой и протеомикой — это сложное взаимодействие генов и белков, которое, в конечном счете, является молекулярной основой заболевания.

Для судебной токсикологии также важны генетические данные, чтобы адекватно интерпретировать результаты экспертизы. Например, зная пути и скорость битрансформации ксенобиотика в организме, можно оценить связь между концентрацией вещества в крови и его токсической дозой, степень нанесенного вреда здоровью пострадавшего.

В 2006 г. в 3 ведущих научных журналах «Nature», «Nature Genetics» и «Genome Research» были одновременно опубликованы результаты исследований 13 научных центров Великобритании и Америки, касающиеся генетических различий людей. Теперь ученые считают, что вариабельность объясняется наличием у людей множества копий некоторых важных генов, образующих человеческий геном. Согласно полученным данным, идентичность людей может оказаться не 99,9 % (как считали еще в 2004 г.),  а  скорее 99 %, но и этого достаточно, чтобы объяснить множество наших различий. Считают, что у человека не две копии каждого гена — по одной от каждого из родителей, —  а  более. Число множественных копий различно у разных людей, и этим объясняются наши физические и интеллектуальные отличия. Исследователи предполагают, что вариации в количестве копий генов — это здоровая норма,  а  потеря или приобретение копий некоторых важных генов может провоцировать многие заболевания. Пока трудно ответить на вопрос о возможном количестве копий для одного гена. Например, в журнале "Science" (2006) сообщается о том, что ген MGC8902, активность которого отмечена в отделах мозга, связанных с когнитивными функциями (восприятие, хранение, передача информации), представлен в геноме человека в количестве 212 копий. Другой пример: в результате полной расшифровки геномов 270 индивидов европейского, азиатского и африканского происхождения удалось обнаружить у них значительные вариации в числе копий одних и тех же фрагментов ДНК.

Модификация генетического материала человека химическими или физическими агентами (например, радиацией) представляет одно из наиболее серьезных последствий воздействия токсикантов. Однако число агентов или процессов, которые известны как приводящие к таким изменениям, ограниченно.

Генетическая токсикология оценивает результаты воздействия различных факторов на происходящие в организме генетические процессы. Под генотоксичностью следует понимать способность химических, физических и биологических факторов оказывать повреждающее действие на генетические структуры организма. Малая часть последовательности ДНК копируется в протеинкодируемую РНК. Кодируемая последовательность основных пар называется экзон, некодируемая — интрон. Большинство токсикантов оказывают неблагоприятное воздействие, прямо или косвенно нарушающее нормальные процессы передачи сигналов в клетке. Считается, что ксенобиотики инициируют последовательность событий, начинающихся с рецептора, сдерживающего/активизирующего генную и протеиновую экспрессию. Экспрессия гена — активизация транскрипции гена, в процессе которой на смысловой нити ДНК синтезируется мРНК. Поскольку мРНК являются предшественниками ферментов, измерение их относительного содержания в образцах ткани или клеток, подверженных действию токсиканта, показывает потенциальное вовлечение генов в этиологию токсичности. Это не новая мысль, однако, согласно гипотезе, основанной на многочисленных исследованиях и наблюдениях, полагают, что механизмы стрессовых факторов предшествуют возможному повреждению генов. Потенциальные мутагены можно разделить на физические, биологические и химические агенты. Многие характеристики индуцированной излучением мутации считаются схожими с таковыми химически индуцированной мутации. Первые работы в области химического мутагенеза относятся к началу 30-х годов ХХ века, когда была открыта мутагенная активность йода аммиака (В.В. Сахаров и М.Е. Лобашев) и алкалоида колхицина (A. Dustin). В 1946 г. И. А . Рапопорт и Ш. Ауэрбах (независимо друг от друга) сообщили о способности формальдегида и иприта индуцировать частоту мутаций, сопоставимую по величине с действием ионизирующей радиации.

Химические мутагены выявлены в 10 классах соединений, включая ароматические циклы, эфиры, галогенированные алифатические и ароматические углеводороды, нитрозамины, некоторые пестициды, эфиры фталевой кислоты, некоторые фенолы, некоторые полихлорированные дифенилы и ароматические полициклы.

С помощью микронабора ДНК можно измерять уровень экспрессии в тысячах генах одновременно (1990 г.). Как микроанализ ДНК может помочь в токсикологических исследованиях?

Образец экспрессии генов является уникальным по выявлению конкретных типов повреждений по сравнению с установлением или измерением единичного фермента или метаболита (рис. 5), так как содержание метаболитов и активность ферментов могут быть изменены под влиянием многих факторов (16, 17, 46, 64, 65).

Image

Рис. 5. Определение экспрессии генов как диагностический и прогностический тест.

Измерение генной экспрессии направлено на увеличение чувствительности и специфичности диагностических исследований (рис. 6).

Image

Рис. 6. Гены-агрессоры генома человека, влияющие на развитие различных патологических состояний (Е.С. Северин и соавторы, 2004 г.).

Однако повышение чувствительности теста не должно навредить пациенту. Так, некоторые изменения в экспрессии генов не означают проявления неблагоприятных эффектов. Ответственность за оценку генной экспрессии лежит на ученом, который должен учитывать другие дополнительные данные для получения наиболее адекватного вывода из исследований. Для однозначной оценки повреждений органов при клинических испытаниях новых лекарственных средств нередко возникает необходимость в применении альтернативных методик. Например, высокая активность аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ) считается признаком гепатоцеллюлярного повреждения. АЛТ преимущественно находится в клетках печени, поэтому изменение ее активности более специфично для заболеваний печени; АСТ присутствует в сердце, скелетных мышцах, мозге, почках,  а  также в печени. Уровень активности и АЛТ, и АСТ, как известно, повышается при инфаркте миокарда, сердечных нарушениях, мышечных заболеваниях, заболеваниях центральной нервной системы и других расстройствах. Количественная оценка имеет малую прогностическую ценность и не всегда соответствует степени повреждения печени. При выявлении токсических эффектов эти маркеры неспецифичны и могут изменяться под действием других факторов, не относящихся к повреждению печени. Результаты генетических исследований являются наиболее чувствительными и специфичными диагностическими и прогностическими тестами (26, 72, 74).

Высокоспецифичные изменения экспрессии генов помогают установить механизм токсичности химического агента, например, последовательность передачи сигнала или причины ингибирования ферментных систем, что в дальнейшем даст возможность определить эффективные биомаркеры, предупредить лекарственные взаимодействия, предвидеть побочные эффекты

 

 

Последнее обновление ( 06.04.2009 г. )
 
« Пред.   След. »


Copyright 2012 Bioinformatix.ru