Метаболомика и метабономика - современные технологии токсилогических исследований(часть 2). - BioinforMatix.ru - портал по биоинформатике, имейджингу и биософту

Метаболомика и метабономика - современные технологии токсилогических исследований(часть 2).

Печать E-mail
Автор Н.И. Калетина   
14.10.2008 г.

Соотношение экспрессии генов и фенотипа.

Совокупность параметров экспрессии генов свидетельствует о состоянии соответствующего органа (61, 72). Фенотип может быть определен с помощью клинических исследований, функциональных тестов, измерения компонентов сыворотки крови и гистологической оценки. Связывание генной экспрессии с подобными изменениями — ключ к поиску биомаркеров токсических эффектов и формирование возможной гипотезы относительно механизма действия токсиканта (20, 34. 41, 53). Прежде чем пытаться установить соотношение изменений экспрессии генов и фенотипа, необходимо разобраться   в  физиологии органов. Например, почка часто служит мишенью для токсикантов окружающей среды и определенных классов лекарственных соединений. «Склонность» почки к повреждению связана с ее уникальным анатомическим строением и физиологическими функциями. Клетки проксимального канальца реабсорбируют большинство ионов воды (Na+, Ca2+, K+, Cl-, HCO3-, PO43-) и различных метаболитов.  В  табл. 1 приведены примеры веществ, проявляющих токсическое действие на почку.

Табл. 1. Примеры веществ, проявляющих токсическое действие на почку.

Металлы

 

Галогено-

производные углеводородов

 

Природные токсины

Анальгетики

Антибиотики

Другие

лекарственные препараты

Кадмий

Бромбензол

Охратоксин А

 

Ацетоамино-

фенон

 

Гентамицин

Цисплатин

Ртуть

 

Тетрахлорметан

 

Фумонизин

НПВП*

Митомицин

 

 

Свинец

 

Хлороформ

Цитрин

 

Циклоспорин

 

____________________________________

*) Нестероидные противовоспалительные препараты

Перечисленные токсиканты имеют различную химическую природу. По-видимому, за проявление почечной токсичности отвечает не только структурная особенность молекулы ксенобиотика. Для оценки изменений генной экспрессии, происходящих под влиянием классических почечных токсикантов, были проведены токсикогенетические исследования (10, 14, 24). Известно, что мишенью цисплатина — цис-дихлородиамин платины II (CIS) и охратоксина А (OTA) — является сегмент проксимального канальца S3. CIS токсичен для представителей всех биологических видов и без ферментативной активации преобразовывается  в  предельно токсичную форму. CIS имеет изомерную транс-конфигурацию, которая называется «трансплатин» и не является токсичной. Токсичность CIS может выявляться несколькими способами, включающими измерение креатинина плазмы, мочевины крови и т. д.

ОТА — токсин, выделенный из особых видов грибов, включающих Aspergillus ochraeus и Penicillium verrucosum, присутствующих во множестве различных продуктов и напитков, таких, как зерновые, орехи, специи, кофе и красное вино. Подобно CIS, ОТА вызывает токсичность проксимального канальца почки  в  сегменте S3. Проводили независимые исследования генной экспрессии  в  почке, на которую воздействовали токсическими дозами CIS и OTA (45, 56, 68). При этом наблюдали почти одинаковые гистопатологические изменения, включающие некроз S3-клеток проксимального канальца и рассеянный апоптоз. Оба соединения накапливались  в  определенной области проксимального канальца.  В  этих исследованиях гистологическая оценка явилась отправной точкой проверки взаимосвязи параметров генной экспрессии и морфологических повреждений. Анализировали гены крыс, которым вводили CIS или ОТА. Несмотря на то, что  в  исследование были включены только 250 генов, удалось обнаружить несколько функциональных классов генов, ответственных за клеточный транспорт, повреждение ДНК и метаболизм (68). Из-за того, что клетка должным образом не выполняет свои обычные функции для предотвращения критических процессов, изменяется метаболизм генов. Острая фаза генного ответа наступает при возникновении соответствующего количества различных клеточных нагрузок. Таким образом, структурно и фармакологически разные соединения, делящие одни и те же токсикологические конечные точки, имеют сходство  в  экспрессии генов. Такие гены могут быть удовлетворительными биомаркерами. Кандидаты  в  биомаркеры должны соответствовать многим требованиям, включая возможность раннего детектирования, чувствительность и специфичность анализа. При этом гены, чьи протеиновые продукты секретируются  в  кровяное русло, являются лучшими кандидатами, по сравнению с другими биомаркерами.  В  настоящее время для обнаружения токсикантов ведущие лаборатории мира активно проводят поиск и выбор биомаркеров по описанной выше схеме. Высокоточные технологии экспрессии генов позволяют находить характерные черты, уникальные для специфичных токсикантов (27, 55, 59, 60, 78).

Ожидается, что эта технология даст ответы на приведенные ниже и многие другие вопросы:

- насколько отличаются клетки различных тканей  в  результате чрезвычайно разных ответных реакций на введенный токсикант?

- различные биологические виды проявляют лишь частично совпадающие или индивидуальные черты генного ответа на действие одного и того же токсиканта?

- возможно ли использование полученных данных для определения срока заболевания и оценки риска?

- возможно ли использовать изменения генной экспрессии как индикаторы ответных реакций на введение сложных химических смесей?

- поможет ли эта технология установить уникальность ответных реакций организма на хроническое поступление низких доз токсикантов, характеризующееся совокупностью параметров генной экспрессии?

- существует ли возможность обнаружения специфических характеристик генного полиморфизма, характеризующих повышенную склонность к экологически обусловленным заболеваниям?

 В  настоящее время совокупность параметров высокоточной генной экспрессии уже помогает  в  выборе генных мишеней, находящихся  в  определенной зависимости от силы воздействия токсических эффектов. Безусловно, интерпретация изменений экспрессии генов возможна лишь  в  совокупности с данными клинической химии, гистологических исследований и других параметров, определяющих фенотип.

Одна из самых сложных проблем генетической токсикологии связана с возможностью увеличения частоты мутаций  в  соматических и половых клетках человека  в  результате воздействия химических веществ — генотоксикантов. Соматические мутации — как генные, так и хромосомные — не передаются потомству человека, подвергшегося воздействию токсиканта, однако повышение частоты этих мутаций может способствовать развитию приобретенных заболеваний,  в  первую очередь рака.

К генотоксикантам относят:

 -мутагены — агенты различного происхождения, вызывающие наследуемые изменения  в  геноме;

 -митогены — факторы или вещества, влияющие на процессы клеточного деления;

 -анэугены — факторы, способствующие увеличению или уменьшению гаплоидного или диплоидного числа хромосом на одну или более;

 -кластогены — факторы, индуцирующие хромосомные разрывы;

 -морфогены — факторы, вызывающие ненаследуемые генетические изменения (морфозы) на уровне реализации признака  в  онтогенезе.

Мутация — внезапное изменение  в  наследственных структурах (ДНК, ген, хромосома, геном). Генетический материал организован  в  иерархию структурно-функциональных единиц — от молекулярных сайтов внутри гена до целых хромосом и геномов. Соответственно существуют разные типы мутаций — от генных до геномных.

Генная мутация — изменение последовательности нуклеотидов  в  определенном участке молекулы ДНК.

Хромосомная мутация — любое нарушение структуры хромосом (делеция, дупликация, инверсия, транслокация).

Геномные мутации заключаются  в  изменении числа хромосом  в  кариотипе. Увеличение числа хромосом, кратное гаплоидному набору хромосом, называют полиплоидией. Отсутствие или избыточное количество отдельных хромосом объединяют понятием «анэуплоидия», которую подразделяют на гиперплоидию (увеличение числа хромосом) и гипоплоидию (потерю отдельных хромосом хромосомного набора). Геномные мутации возникают за счет повреждений  в  процессе мейоза, ведущих к нерасхождению хромосом или хроматид по дочерним клеткам. Общая частота геномных и хромосомных мутаций  в  соматических клетках человека составляет порядка 1 %, а  в  зародышевых — примерно 0,5 %.

Генные мутации, хромосомные отклонения (морфологические уродства) и анэуплодия — факторы, участвующие  в  развитии рака. Многие мутагены и кластогены выступают  в  роли инициаторов канцерогенеза. Однако мутагены, кластогены и анэугены могут также вызывать множественные генетические изменения. Мутации  в  зародышевых клетках, как и  в  соматических, обычно делят на две большие группы — хромосомные (численные и структурные) и генные.

Онкогены — гены, стимулирующие превращение нормальных клеток  в  раковые. Воздействие онкогенов является генетически доминантным, что проявляется  в  том, что единичный активный онкоген действует даже  в  том случае, когда его нормальная аллель присутствует  в  той же клетке. Онкогены возникают, когда гены, называемые протоонкогенами, участвующие  в  нормальном процессе роста и развития клеток, подвергаются генетическим изменениям. Генные мутации  в  гене-подавителе опухоли на хромосоме 17, известном как р53, возникают при различных видах раковых опухолей, и молекулярная характеристика мутаций р53 позволяет связать некоторые виды рака у человека с влиянием мутагенов. Среди хромосомных изменений, активирующих протоонкогены, заметно преобладают транслокации. Транслокация может активировать протоонкоген, перемещая его  в  новое место  в  хромосоме с более активным промотором, где его действие усиливается.

Промотор — регуляторный участок гена, с которым связывается РНК-полимераза перед началом транскрипции.

Транслокация — передача наследственной информации; синтез белковой молекулы или перевод последовательности оснований мРНК  в  последовательность аминокислот полипептидной цепи.

Оценка риска раковых заболеваний включает  в  себя исследование чувствительности различных видов и субпопуляций к индуцированию опухоли химическим веществом и построение графика зависимости «доза-ответ», связывающей количество мутаций и дозу химического вещества. Чтобы исследовать генетический риск, оценивается частота генетических изменений  в  человеческих зародышевых клетках путем экстраполяции данных, полученных на соматических клетках и зародышевых клетках грызунов. Для полной оценки генетического риска необходимо дать статистическую оценку частоты генетических изменений, передающихся потомству.

Среди аномалий лидирует анэуплодия, затем следует полиплоидия. Так, анэуплодия может привести к смерти плода и вызвать различные расстройства, например, синдром Дауна. Структурные отклонения составляют 5 % всех генетических нарушений. Большинство хромосомных аномалий, обнаруживаемых у новорожденных, возникают de novo  в  зародышевых клетках родителей.

Механизмы индуцирования генетических изменений.

Типы повреждений ДНК варьируются от разрыва одной или двух спиралей ДНК до пересечений между основаниями ДНК, между участками ДНК и белками, получения аддуктов ДНК при взаимодействии их азотистых оснований с химическими агентами. Ионизирующее излучение вызывает разрыв одной или двух спиралей ДНК, а также широкий спектр повреждений оснований. Относительные пропорции различных классов повреждений ДНК зависят от типа радиации. Ультрафиолетовое излучение, относящееся к разряду неионизирующих излучений, часто вызывает образование циклобутановых пиримидиновых димеров и продуктов фотолиза. Эти повреждения могут быть количественно оценены химическими и иммунологическими методами.

Химические вещества могут вызывать изменения оснований либо непосредственно  в  качестве аддуктов, либо опосредованно через интеркаляцию химического соединения между парными основаниями (рис. 7). Многие электрофильные химические соединения вступают  в  реакцию с ДНК, образуя ковалентно связанные продукты (аддукты) (9).

Image

Рис. 7. Повреждения, которые могут возникать  в  ДНК спонтанно или под действием разных агентов (Burgers P.M.J. et al., 2001).

Алкилирование оснований может привести к его отрыву от ДНК, что образует беспуриновый или беспиримидиновый участок, который обычно называется АП-сайтом (участком). Включение посторонних оснований  в  АП-сайт приводит к мутациям. Объемные аддукты  в  ДНК распознаются клеткой так же, как и повреждения, вызываемые ультрафиолетовым излучением, и подобным же образом исправляются.

Эндогенные агенты ответственны за несколько тыс. повреждений ДНК, ежедневно происходящих  в  каждой клетке, преимущественно — за изменения оснований ДНК (например, 8-оксигуаниновых) и АП-сайтов.

Клеточные процессы, которые могут привести к повреждениям ДНК — это накопление АФК, дезаминирование цитозинов и (или) S-метилцитозинов, приводящее к образованию соответственно урацила и тимина.

Процесс репликации ДНК чреват возможными ошибками, например полимеразой может быть добавлено постороннее основание.

Два вида процессов помогают клетке устранять повреждения своей ДНК. Если повреждения значительны, то клетка может войти  в  стадию апоптоза (см. выше). Если повреждение менее значительно, то  в  клетке происходят процессы восстановления: безошибочная или чреватая ошибками починка (репарация) ДНК.

Принципы, лежащие  в  основе большинства процессов починки:

 -распознавание повреждения;

 -устранение повреждения (за исключением разрыва спиралей или расщепления пиримидиновых димеров);

 -синтез репарированной ДНК;

 -лигация (образование связей).

 

Прямое исправление повреждений.

Наиболее частая причина точечных мутаций у человека: это спонтанное добавление метильной группы — один из типов алкилирования. Такие модификации исправляются без разрушения цепи ДНК ферментами — гликозилазами. Фермент О-6-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераз (MGMT) защищает клетку от токсических эффектов, производимых алкилирующими агентами, переводя для этого метильную группу из О-6-метилгуанин-ДНК  в  цистеиновый остаток  в  MGMT.

 

Починка путем вырезания основания (эксцизионной репарации основания — BER).

Главные способы, посредством которых происходит починка оснований ДНК, включают устранение поврежденного основания, которое осуществляют ферменты нуклеазы. Возникающая лакуна может быть заполнена ДНК-полимеразой, что сопровождается лигацией с родительской ДНК. Окислительные повреждения, как основные, так и индуцированные, являются важными причинами для починки оснований ДНК.

 

Починка путем вырезания нуклеотида (эксцизионной репарации нуклеотида — NER).

Система NER обеспечивает способность клетки устранять объемные повреждения  в  ДНК. NER удаляет содержащий повреждение олигонуклеотид из ДНК посредством распознавания повреждения, разреза, вырезания, нового повторного синтеза и лигации. ДНК-полимеразы (у эукариот их известно более 15) различаются по ряду признаков,  в  том числе по количеству нуклеотидов, которые они могут встроить  в  растущую цепь за один акт связывания с дуплексом ДНК. присоединяют один нуклеотид, а при участии белка l и bДНК-полимеразы   e и dPCNA (proliferating cell nuclear antigen) ДНК-полимеразы  способны вставить фрагмент необходимой длины. Повреждения ДНК  в  активно транскрибирующих генах, особенно  в  транскрибирующей спирали, чинятся  в  первую очередь и потому быстрее, чем повреждения ДНК  в  остальной части генома. Так клетка защищает целостность процесса транскрипции.

 

Репарация ошибок спаривания — мисмэтч репарация (mismatch — MMR).

Этот метод исправляет ошибочно встроенные неповрежденные основания, которые не образуют нормальное Уотсон-Криковское спаривание (A • T, C • G). Такие ошибки иногда происходят при репликации с помощью ДНК- полимеразы.  В  MMR участвуют ферменты, вовлеченные  в  BER и NER, а также специализированные ферменты. .e и dСинтез ДНК при MMR осуществляется ДНК-полимеразами


Гомологичная рекомбинация.

У эукариот существует два основных способа устранить двухцепочечные разрывы: гомологичная рекомбинация (рекомбинационная репарация) и соединение негомологичных концов. Прямое соединение сломанных концов требует специальных ферментов, которые узнают и связывают разорванные концы с последующим их сшиванием. Починка разрывов двойной спирали (и разрывов одной спирали) обычно включает  в  себя продуцирование трехконечного односпирального хвоста с помощью экзонуклеаз или геликаз. Посредством инвазии спирали, при которой односпиральный хвост вторгается  в  неповрежденную гомологичную молекулу ДНК, синтезируется ДНК. Одновременно образуется так называемое холлидеевское сочленение  в  комплексе ДНК. Через промежуток этого сочленения проводятся две молекулы ДНК (как со структуральным перекрестом, так и без него), каждая из которых более не содержит разрывов.

 

Негомологичное соединение концов—NHEJ (Nonhomologous End-Joining).

Если разорванная ДНК имеет тупые концы, и соединение двух фрагментов ДНК происходит случайно, то такая репарация называется NHEJ. Главным компонентом NHEJ восстановительного комплекса является зависящий от ДНК белок киназа (DNA-PK), или белок Ku — гетеродимерная субъединица, состоящая из двух белков Ku70 и Ku80. Этот белок служит для выравнивания концов разорванной ДНК, чтобы упростить процесс их склеивания или выступает  в  качестве сигнальной молекулы для мобилизации других восстанавливающих белков.

 

Возникновение генных мутаций.

Генная, или точковая, мутация представляет собой изменение последовательности нуклеотидов  в  пределах одного гена, приводящее к изменению характера действия гена.

Точковые мутации можно разделить на несколько типов  в  зависимости от характера молекулярного изменения  в  гене (см. ниже).

-Missense-мутация.  В  одном из триплетов происходит замена одного основания (например, ЦТТ → ГТТ),  в  результате чего измененный триплет кодирует аминокислоту, отличную от той, которую кодировал прежний триплет. Замены основания — это замещение правильного нуклеотида посторонним; они могут далее подразделяться на «переходы», при которых одно пуриновое основание заменяется другим пуриновым или одно пиримидиновое другим пиримидиновым и «трансверсии».

-Мутация со сдвигом рамки считывания. Если  в  последовательность ДНК включается новое основание или пара оснований, то все лежащие за ними триплеты изменяются, что влечет за собой изменение синтезируемого полипептида. Среди этих мутаций наиболее значительная часть продуцируется ошибками репликации ДНК.

-Nonsense-мутация.  В  результате замены одного основания возникает новый триплет, представляющий собой терминирующий кодон.  В  генетическом коде имеется три таких триплета. При такой замене цепь отличается своим свойствам от полипептида, который синтезировался прежде.

-Синонимическая missence-мутация. Генетический код обладает значительной избыточностью: два или несколько его триплетов кодируют одну и ту же аминокислоту. Поэтому можно ожидать, что  в  некоторых случаях при замене оснований один триплет заменяется другим — синонимическим, кодирующим ту же аминокислоту. Такие синонимические мутации, вероятно, довольно обычны.

Относительная частота мутаций является результатом состязания между починкой и репликацией. Чем больше починок, производящихся перед репликацией, тем меньше частота мутаций для данного количества индуцированных повреждений ДНК. Значимыми регуляторами этого состязания являются проверочные гены клеточного цикла (например, р53), поскольку если клетка не допускается для входа  в  S-фазу на проверочном пункте G1/S, то возможно большее число починок, прежде чем клетка начнет воспроизводить свою ДНК.

Оценка генетического риска.

Важным моментом  в  оценке генетических мутаций, индуцированных химическими агентами  в  зародышевых клетках, является отношение между экспозицией и длительностью репликации ДНК (то есть если повреждение нанесено, может ли оно быть починено до репликации?). Стволовая клетка сперматогония является главным объектом для оценки генетического риска, поскольку она, как правило, присутствует  в  организме мужчины  в  течение всего репродуктивного периода. Каждый раз, когда стволовая клетка сперматогония делится, она производит дифференцирующийся сперматогоний и новую стволовую клетку. Эта клетка может накапливать генетические повреждения от хронических экспозиций.  В  генезисе яйцеклетки первичный ооцит задерживается перед рождением, и дальнейшая S-фаза не имеет места до образования зиготы. По этой причине ооцит защищен от генетических мутаций, вызываемых большинством химических агентов.

 Продолжение следует.

Последнее обновление ( 07.04.2009 г. )
 
« Пред.   След. »
<


Copyright 2012 Bioinformatix.ru