Метаболомика и метабономика - современные технологии токсилогических исследований (часть 3). - BioinforMatix.ru - портал по биоинформатике, имейджингу и биософту

Метаболомика и метабономика - современные технологии токсилогических исследований (часть 3). - BioinforMatix.ru - портал по биоинформатике, имейджингу и биософту

Метаболомика и метабономика - современные технологии токсилогических исследований (часть 3).

Печать E-mail
Автор Н.И. Калетина   
14.10.2008 г.

 Методы генетической токсикологии служат двум взаимосвязанным, но различным целям в токсикологической оценке химических веществ: 

- характеристика функциональных зависимостей «доза-ответ» и механизмов мутагенеза.

Некоторые методы определяют прямые мутации,   а  другие — обратные мутации. Прямые мутации — это генетические изменения в первозданном гене, они обнаруживают себя изменением фенотипа, вызванном изменением или утратой функции гена. Обратная мутация восстанавливает функцию гена в мутанте и приводит к возвращению первозданного фенотипа.

Многие соединения, не являющиеся сами по себе мутагенными или канцерогенными, могут превратиться в мутагены и канцерогены вследствие обмена веществ в организме. К настоящему времени известно приблизительно 2.000 аутосомных доминантных признаков у человека. Частично совпадающие или индивидуальные характеристики генного ответа на определенный токсикант используют для выработки стратегии лечения экологически обусловленных заболеваний, выбора лекарственной терапии. Для правильной интерпретации результатов судебно-химической экспертизы или клинико-токсикологического исследования также важны данные генетического анализа.

Вот несколько примеров. Гены алкогольдегидрогеназы печени представлены тремя полиморфными локусами (ADH-1, ADH-2, ADH-3), альдегиддегидрогеназы — двумя (ALDH-1 и ALDH-2). Наследственными вариациями в молекулах двух ферментов, расщепляющих этанол, объясняются специфические реакции на алкоголь людей, у которых отсутствует изоформа ALDH-1. После употребления малых количеств алкоголя немедленно краснеет лицо, возникают тахикардия, жжение в желудке, мышечная слабость и другие признаки отравления. У некоторых больных появляется злокачественная гипертермия при ингаляционном наркозе (фторотан и др.), температура тела повышается до 44° С, развиваются тахикардия, гипоксия, ацидоз, гиперкалиемия. Причиной злокачественной гипертермии является мутация в гене рианодинового рецептора и других генах. В хирургии для мышечной релаксации применяется дитилин. Обычно этот препарат, действующий по типу яда кураре (остановка дыхания), быстро разлагается сывороточной холинэстеразой. Если холинэстераза — атипичная (из-за мутации в соответствующем гене), то при введении дитилина происходит остановка дыхания на 1 час., и  в течение этого времени больных можно спасти только искусственной вентиляцией легких. Становится ясно, что чем более специализировано новое лекарство, тем более вероятно «выпадение» определенного числа пациентов из успешного лечения.

Любые фармакогенетические реакции развиваются на основе широкого генетического полиморфизма в человеческих популяциях, эволюционно сформировавшегося до появления новых фармакологических средств. Успехи токсикогенетики позволили понять толерантность и повышенную чувствительность к лекарственным препаратам у отдельных лиц. От достижений токсикогенетики во многом зависит индивидуализация лечебных мероприятий (выбор аналога, дозы, способа введения). Хорошо известна значительная вариабельность эффективности и побочных действий лекарств у разных групп населения и отдельных лиц. Клинические испытания лекарственных препаратов проводятся для выявления побочных эффектов у 1 из 500 или из 1.000 человек, и маловероятно, что они учитываются у 1 из 50.000. При введении стандартной дозы лекарства его концентрация в крови у одних людей через определенный промежуток времени оказывается ниже оптимальной,  а  у других достигает токсического уровня (79, 80).

Индивидуальная переносимость химических соединений, толерантность организма человека к токсикантам обусловлены генетическими особенностями каждого индивидуума (23, 28, 42). Разработанные чувствительные маркеры используются при скрининге соединений на этапе клинических испытаний для получения надежных результатов. Токсикогенетика и токсикогеномика разрабатывают высокопроизводительные технологии анализа генетического материала для оценки рисков действия различных токсикантов и развития побочных эффектов лекарственной терапии в зависимости от индивидуального гено- и фенотипа. Выявление генетических особенностей, определяющих индивидуальные реакции организма на действие химических веществ, позволяет целенаправленно прогнозировать побочные эффекты и применять препараты для определенных групп пациентов согласно их генетическому паспорту. Вариабельность генома человека (примерно 3 млрд. пар оснований) по современным оценкам, составляет от 2 до 10 млн. пар оснований, часть из которых и определяет индивидуальные особенности ответа на воздействие препаратов.

Воздействие ксенобиотиков на организм реализуется через реакции, осуществляемые специфическими ферментативными системами клеток. В цепи метаболических превращений окисление исходной молекулы часто называют этапом активации, который осуществляется в основном изоферментами цитохрома Р450 и, реже, флавинсодержащими монооксигеназами и алкогольдегидрогеназами (I фаза). Этап детоксикации (II фаза) осуществляется эпоксидгидролазами, глутатион-S-трансферазами, сульфатазами и др. Хорошо известно, что вариабельность некоторых цитохромов суперсемейства цитохромов Р450 обусловливает различную скорость биотрансформации ксенобиотиков. Так называемые «быстрая» и «медленная» группы пациентов отличаются по показателям накопления и выведения химических соединений в 10-100 раз. Увеличение эффективности действия лекарственных препаратов повышает и риск развития побочных эффектов. По данным Американской медицинской Ассоциации, в США в 1994 г. развитие побочных реакций явилось причиной госпитализации 2 млн. человек и 100.000 смертельных случаев. Побочные реакции на прием лекарственных препаратов занимают 4-6 места среди причин смерти в США.

Большинство каскадов реакций с участием микросомальных ферментов имеют в качестве терминального звена цитохром Р450. В организме цитохром Р450 существует в виде множества изоформ (на сегодняшний день известно порядка 400), кодируемых различными генами (18, 27, 76, 79, 80). Эти белки обладают различной, иногда перекрывающейся, субстратной специфичностью и различными механизмами регуляции экспрессии. Большинство изоформ цитохрома являются индуцируемыми, то есть их количество в клетках значительно увеличивается при появлении субстрата. В соответствии с принятой номенклатурой, семейства обозначаются римскими цифрами, подсемейства — заглавными буквами латинского алфавита,  а  отдельные изоформы — арабскими цифрами. Каждая изоформа имеет специфический спектр метаболизируемых субстратов. Но при этом одно и то же соединение может метаболизироваться различными изоформами Р450 с образованием как одинаковых, так и различающихся продуктов. В зависимости от преобладания в клетке той или иной изоформы может меняться и состав продуктов реакции, в частности, соотношение продуктов активации и детоксикации. У генов ряда изоформ существуют аллельные варианты с различной ферментативной активностью белка-продукта. Наличие таких аллелей в значительной степени обусловливает существование внутривидовых и межтканевых различий в чувствительности к различным токсикантам. Есть 39 генов, кодирующие изоформы цитохрома P450 (47). Три подсемейства (1, 2 и 3) включают 19 изоформ. Полиморфизм были выявлены в нескольких изоформах (CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2E1 и CYP3A4). Генетический полиморфизм, связанный в особенности с CYP2D6, важен с токсикологической точки зрения. Например, есть препараты, для которых биотрансформация в организме регулируется этим ферментом (опиаты, b-блокаторы, антиаритмические препараты и антидепрессанты). Другие ксенобиотики действуют как ингибиторы этого фермента (метадон, декстропропоксифен) и, таким образом, увеличивают их токсичность. У пациентов с мутациями в CYP2D6 происходит нарушение метаболизма препаратов, и они имеют тенденцию накапливаться в организме. Следовательно, значительно возрастает риск токсичности, если доза не подобрана согласно генотипу.

Так, главный метаболит кодеина, декстрометорфана и этилморфина — морфин. Приблизительно 7 % уроженцев Кавказа имеют дефицит фермента, обеспечивающего метаболический путь указанных ксенобиотиков. В этой связи у таких пациентов образуется недостаточное количество морфина, и аналгезирующий эффект проявляется слабее.

Другие примеры.

CYP1A1 — ген, кодирующий фермент арилуглеводородкарбоксилазу (АНН — aryl hydrocarbon hydroxylase) из суперсемейства цитохромов Р450. Субстратом для этой изоформы являются вещества, содержащиеся в табачном дыме, которые при оксигенировании превращаются в токсичные производные фенола и различные эпоксиды (5, 15, 19). АНН участвует в метаболизме эстрогенов и осуществляет гидроксилирование эстрадиола, что приводит к его активации. На сегодняшний день идентифицированы 4 полиморфизма в гене CYP1A1.

Цитохром CYP1A2 участвует в метаболической активации проканцерогенных ариламинов и гетероциклических аминов, образующихся при термической обработке пищи. Фермент клеток печени, который участвует в метаболизме амфетаминов, сердечных гликозидов, нитрозаминов и ряда других веществ, кодируется геном CYP2D6. У европеоидов (в зависимости от ареала обитания) 5-10 % населения гомозиготны по аллелю, при котором данный фермент отсутствует.

Примером фермента, не принадлежащего к группе цитохромов, является NADPH-хиноноксидоредуктаза 1 (ген NQO1). Этот фермент катализирует превращение хинонов в относительно стабильные гидрохиноны, подвергающиеся конъюгации и выведению. При этом предотвращается образование полухиноновых радикалов с последующим формированием АФК (55, 58, 67). Экспрессия гена NQO1 индуцируется окислительным стрессом, влиянием циклических углеводородов табачного дыма и промышленных акрилатов. NQO1 играет ключевую роль в детоксикации бензола, инактивируя хиноны, образующиеся в результате метаболизма. Обнаружены два полиморфных сайта в гене NQO1: С609Т (NQO1*2) и Т464С (NQO1*3)

Полиморфизм NQOP2 можно считать нонсенс-мутацией, так как он приводит к появлению стоп-кодона и отсутствию белка-продукта, однако частота встречаемости его в различных популяциях варьирует (13—30 %). Аллель NQO1*3 встречается реже, его частота не превышает 5 %. Для фермента этой аллели показано снижение энзиматической активности в 2 раза по сравнению с нормальным ферментом (77).

Гликопротеин Р — транспортный белок, основными функциями которого являются препятствие всасыванию ксенобиотиков в кишечнике и предотвращение их проникновения через гистогематический барьер при попадании в организм,  а  также скорейшее выведение в желчь и мочу. Р-гликопротеин — АТФ-зависимый транспортер — содержится в печени, кишечнике, почках и эпителиальных тканях, кодируется определенным набором генов. С токсикологической точки зрения, при генетических вариациях взаимодействие лекарств на уровне всасывания или экскреции может привести к накоплению препаратов и увеличению токсичности.

Субстрат, окисленный при участии цитохрома Р450 или какого-либо другого фермента, подвергается далее воздействию ферментов конъюгации, катализирующих включение в молекулу вещества водорастворимых остатков: глутатиона, серной кислоты и др. В результате метаболит становится гидрофильным и выводится из организма с мочой. На этом этапе работают S-трансферазы, эпоксидгидролазы, УДФ-глюкуронилтрансферазы и ацетилтрансферазы. В случае сниженной активности фермента (например вследствие присутствия специфической аллели гена) в клетке будет происходить накопление продуктов I фазы биотрансформации и соответственно повышаться риск повреждения ДНК.

Ряд веществ под действием ферментных систем II фазы биотрансформации, наоборот, способен превращаться в активные канцерогенные метаболиты. Например, гидрирование эпоксидгидролазами 7, 8-оксида бензапирена до гидродиола с дальнейшим образованием из него диолэпоксида приводит к активации молекулы и превращению ее непосредственно в канцерогенный метаболит. Подобный эффект чаще проявляется при сниженной активности ферментов альтернативного пути. Глюкуронизация, как известно, — важнейшая реакция детоксикации соединений. Два генных семейства кодируют изоформы глюкуронозилтрансферазы: UGT1 и UGT2. Мутация изоформы (UGT1A1) приводит к гипербилирубинемии, что связано с последующими нарушениями метаболизма.

Суперсемейство GST — глутатион-S-тpaнcферазы, катализирующие взаимодействие глутамата с электрофильными соединениями, содержащими атомы N, S, О (9, 36, 38). Функциональная роль глутатион-трансферазы заключается в ферментативной конъюгации сульфгидрильной (SH) группы с электрофильными молекулами самих ксенобиотиков или их метаболитов, образовавшихся в процессе I фазы. Подобная детоксикация играет ключевую роль в обеспечении резистентности клеток к перекисному окислению липидов, алкилированию белков и другим процессам с участием свободных радикалов. Существуют несколько классов глутатионтрансфераз в зависимости от субстрата и органной принадлежности ферментов. Их синтез контролируется генами, расположенными на различных хромосомах. Для каждого из них описано несколько видов полиморфизма, который влияет на функциональную активность ферментов.

Глутатионовые С-трансферазы (GST) участвуют в активации и детоксикации многих ксенобиотиков. Так, токсичность парацетамола в больших дозах связана с истощением печеночного глутатионового депо. Отмечена высокая распространенность у людей генетического полиморфизма для нескольких GST, что, как считают специалисты, связано с увеличением риска развития рака, обусловленного экологическими токсикантами.

В метаболизме гетероциклических ароматических аминов у человека важную роль играет ариламин-N-ацетилтрансфераза (NAT). Этот фермент катализирует ацетилирование ароматических и гетероциклических аминов и относится к ферментам II фазы биотрансформации ксенобиотиков. Известны две изоформы NAT человека — NAT1 и NAT2. Считается, что NAT2 обладает меньшей специфичностью и метаболизирует более широкий круг веществ, поэтому именно NAT2 привлекает большее внимание исследователей. NAT2 экспрессируется преимущественно в клетках печени, однако этот фермент синтезируется и в других тканях, в том числе в тканях молочной железы. По фенотипическим проявлениям активности NAT2 людей можно разделить на быстрые, промежуточные и медленные ацетиляторы (ранее выделяли только группы быстрых и медленных ацетиляторов). В настоящее время известны 36 аллелей гена NAT2, которые различаются сочетанием 12 миссенс-мутаций, 4 молчащих мутаций и делеции одного нуклеотида, приводящей к сдвигу рамки считывания. Частоты встречаемости аллелей NAT2 значительно варьируют в разных популяциях. К наиболее распространенным среди европеоидов медленным аллелям относятся кластеры NAT2*5 (Т341С) и NAT2*6 (G590A) (в скобках указана характерная мутация). Кластер NAT2*7 (G857A) представлен, в основном, у монголоидов,  а  NAT2*14 (G191A) — только у негроидов. Увеличение скорости ацетилирования связано с токсическими эффектами некоторых препаратов. Полиморфизм ацетилирования определяет скорость метаболизма препаратов, относящихся к ариламином, гетероциклическим аминам, гидразинам.

Сульфатирование и метилирование также являются важными путями метаболизма многих ксенобиотиков. Сульфотрансферазы (SULT, SULT1 и SULT2) и метилтрансферазы [метилтрансфераза (МТ), катехолметилтрансфераза (COMT), метилтрансфераза тиопурина (TPMT) и триметилтрансфераза (TMT)] катализируют эти реакции. В настоящее время идентифицировано несколько видов полиморфизма для этих ферментов, но их клиническое проявление еще неясно.

Необходимо отметить, что степень канцерогенного воздействия химических соединений на уровне их метаболизма определяется балансом активирующих и детоксифицирующих реакций, осуществляемых полиморфными ферментными системами. Клеточные защитные механизмы против АФК включают следующие ферменты: глутатион-пероксидазу, каталазу и семейство супероксиддисмутаз. Представителем этого семейства является митохондриальная Mn-SOD. Mn-SOD синтезируется в цитозоле и после посттрансляционной модификации транспортируется в митохондрии. Этот фермент катализирует реакцию взаимодействия двух молекул супероксид-анион-радикала с водой с образованием пероксида водорода и кислорода. В гене Mn-SOD присутствует однонуклеотидный полиморфизм (GTT - GCT), приводящий к замене 16 аминокислоты (Val - Ala) в сигнальном пептиде, теряемом в процессе посттрансляционной модификации. Было показано, что при подобной замене происходит изменение вторичной структуры белка (3-складчатый слой вместо α-спирали) и нарушается транспорт фермента в митохондрию.

Анализ генетического полиморфизма ферментов является основой для определения степени индивидуальной химической чувствительности. Основные локусы генома, отвечающие за индивидуальную реакцию пациента, хорошо известны. Развитие технологии определения нуклеиновых кислот позволило сделать первые шаги по внедрения токсикогеномных тестов в практическое здравоохранение. Существенное значение в современных технологиях имеют чувствительность, селективность, экспрессность, производительность, стоимость и информативность анализа. В настоящее время технология биочипов активно используется для определения экспрессионных профилей работы генов и определения однонуклеотидных замен (вариабельных локусов ДНК), являющихся признаками конкретного генотипа. Эта технология позволяет уже сегодня проводить до 300.000 определений в день у одного пациента, составляя основу генетической паспортизации населения. Биочипирование дает возможность определять индивидуальный полиморфный профиль ферментов, например цитохрома P450.

Один из новейших инструментов биологии и медицины ХХI века — биологические микрочипы (biochips) или, как их чаще называют — DNA microarrays — это организованное размещение молекул ДНК на специальном носителе (платформе — пластинке из стекла или пластика площадью около 1  см2), где в определенном порядке расположено до 1 млн. ячеек, содержащих иммобилизованные одноцепочечные олигонуклеотиды с уникальной последовательностью оснований. Базовым принципом для создания ДНК-чипов является линейное узнавание стереокомплементарных оснований (A - T/U, G - C) нуклеиновых кислот (ДНК или РНК). Олигонуклеотиды чипа гибридизуются с меченными, например флуоресцентной меткой, наборами молекул ДНК или РНК. Через некоторое время платформу промывают. Если в наборе имеется олигонуклеотид, комплементарный закрепленному в ячейке, то между ними образуется водородная связь, и при промывании он не будет удален, в отличие от олигонуклеотидов, которым не нашлось комплементарных оснований. Затем производится детекция наличия меченых молекул в ячейках. Информация считывается с помощью флуоресцентного микроскопа или специального лазерного устройства. Чипы такого типа изготавливают в разных фирмах, в частности, в Институте молекулярной биологии (Москва). Способы изготовления биочипов бывают разными. Одна из крупнейших фирм по производству биочипов — «Affymetrix» — производит биочипы таким же способом, каким изготовляют электронные чипы, то есть методом фотолитографии с использованием специальных микромасок и лазера. На одном чипе расположены десятки ( а  иногда и сотни) тысяч пятен размером в несколько микрон. Каждое пятно — это один уникальный фрагмент ДНК длиной в десятки нуклеотидов. Изготовленный таким образом биочип в дальнейшем гибридизуют с меченными красителем молекулами ДНК. После гибридизации на биочипе возникают паттерны — причудливые узоры, различающиеся у нормальных, раковых клеток или клеток, например при различных видах лейкозов, или ДНК, выделенных от разных больных. По виду паттернов можно с большой вероятностью предсказать течение болезни на самой ранней ее стадии. Таким образом, сопоставив нуклеотидные структуры взаимодействующих с исследуемым образцом олигонуклеотидов и интенсивность сигнала, можно собрать информацию о последовательности меченой молекулы ДНК (РНК) или о наличии и количестве искомой последовательности в образце.

В настоящее время, после установления структуры геномов ряда организмов, решается новая задача — как регулируется активность отдельных генов в рамках генома как целого. Современное развитие технологии биочипов позволяет определить функциональное состояние всех генов (то есть какие гены работают в данной клетке на какой-либо стадии развития,  а  какие находятся в неактивном состоянии),  а  также установить взаимосвязь сигнальных регуляторных путей клетки. На биочипах проводят одновременный анализ работы тысяч и десятков тысяч генов и сравнивают экспрессию этих генов в здоровых и в поврежденных клетках. Такие исследования помогают увидеть (сразу, за один эксперимент!) влияние различных факторов (лекарств, экотоксикантов, белков, питания) на работу десятков тысяч генов, создавать новые лекарственные препараты и быстро выяснять, на какие гены и каким образом действуют лекарства, прогнозировать их побочные эффекты. Биочипы позволяют за считанные часы различать формы лейкозов, обнаруживать лекарственно устойчивые формы туберкулеза, тогда как другие методы требуют нескольких недель или даже месяцев, следовательно, быстро выбрать нужный способ лечения, диагностировать другие виды рака.

Биочипы были изобретены в конце 90-х годов ХХ в России и в США. История создания отечественного биочипа связана с именем недавно ушедшего из жизни директора Института молекулярной биологии академика РАН  А . Мирзабековым. В настоящее время биочипы успешно производятся несколькими американскими биотехнологическими компаниями,  а  также в России, в Центре биологических микрочипов Института молекулярной биологии — компанией "Биочип-ИМБ" (Biochip-IMB), см.:

Для армии США разработан специальный биочип, сигнализирующий о наличии бактериальной угрозы. Если на такой биочип попадает ДНК патогенных микробов, то фрагменты ДНК зондов с прикрепленными к ним микроскопическими частицами золота выстраиваются в ряд, между электродами идет ток, и биочип сигнализирует об угрозе (http://www.dnachips.ru/russian/main.html).

В России разработаны биочипы, позволяющие определять при биологической угрозе наиболее вероятные для использования в качестве биооружия возбудители сибирской язвы, оспы, чумы и бруцеллеза.

В последние годы произошел значительный прогресс в методах определения генотипов (в SNP-анализе). Согласно принятому определению, SNP — Single Nucleotide Polymorphisms — это однонуклеотидные позиции в геномной ДНК, для которых в популяции имеются различные варианты последовательностей (аллели), причем редкий аллель встречается с частотой не менее 1 %. Иногда дополнительно определяются «распространенные SNP», для которых частота встречаемости редкой аллели более 20 %. Практический интерес к SNP сильно возрос в ходе реализации проектов по определению полных нуклеотидных последовательностей ряда модельных организмов. В самом определении SNP заложена ориентация на их использование в качестве генетических маркеров (ограничение по частоте встречаемости противопоставляет их редким мутациям). Огромное количество SNP в геноме человека (по различным оценкам, 3-10 млн. распространенных SNP) позволяет отобрать порядка 100.000 SNP-маркеров; при этом на каждый известный или предполагаемый ген приходится в среднем по 2 маркера. Никакой другой тип геномных различий не способен обеспечить такую плотность картирования. Надежный метод геномного скрининга SNP позволил бы разработать стандартный подход к исследованию молекулярной природы предрасположенности к различным заболеваниям и предсказанию индивидуальной чувствительности к химическим, в том числе, лекарственным веществам. Количество методов для SNP-анализа, появляющихся в лабораториях, быстро увеличивается. Для идентификации генетических изменений используют различные методы выявления SNP, например:

- ферментативные, химические (расщепление или лигирование);

- основанные на различной электрофоретической подвижности полиморфных участков ДНК (секвентирование ДНК);

- хроматографические (ВЭЖХ), масс-спектрометрию, резонансное тушение флуоресценции и др.

Альтернативой существующим методам обнаружения полиморфных участков ДНК является масс-спектрометрическое дифференциальное секвентирование. Время, затрачиваемое на анализ каждого образца таким методом, составляет всего несколько секунд, что позволяет оценить долю SNP при анализе нескольких образцов одновременно. Ионизированные молекулы ДНК отрываются от подложки методами MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionisation) — лазерной десорбционной ионизации или ESI (electrospray ionisation) — электроспрейной ионизации (81, 82). Молекулы ДНК разгоняются в электрическом поле и направляются через вакуумную камеру к детектору. Время движения регистрируется. Время обратно пропорционально скорости молекулы, которая, в свою очередь, прямо пропорциональна отношению массы летящей молекулы к ее заряду. Эти параметры (отношение массы к заряду) уникальны для каждой молекулы и определяются исключительно ее нуклеотидной последовательностью, поэтому чувствительность метода чрезвычайно высока. Метод позволяет работать с нанолитрами образца. Масс-спектрометрический анализ успешно применяется для визуализации результатов обнаружения SNP другими методами.

Использование новых технологий уже становится реальностью в работе токсикологов, включая химико-токсикологические анализы и интерпретации результатов экспертиз.

Постгеномные технологии — метаболомика, геномика, протеомика, метабономика имеют большие возможности для определения качественных и количественных изменений метаболических процессов в организме человека при действии токсикантов.

Протеомика изучает полный набор белков, производимых конкретными типами клеток. Она включает определение числа, структуры синтезированных организмом белков, их последовательности «белок — белок» и посттрансляционных модификаций последовательности «белок — другая молекула» при взаимодействии внутри клетки. Таким образом, протеом является понятием, описывающим все эндогенные белки.

Метаболом представляет собой совокупность всех небольших молекул или метаболитов в органелле, клетке, ткани, органе или организме. Простейшая схема взаимодействия генов с метаболитами показана на рис. 8. Геном определяет возможную структуру метаболома,  а  метаболом воздействует (положительно или отрицательно) на экспрессию этой структуры.

 

Image

 

Рис. 8. Схема взаимодействий: от генома до метаболома.

Генетический код генерирует сигналы (транскриптомы), определяющие состав протеома, который, в свою очередь, устанавливает каталитические факторы метаболизма. Регуляция взаимодействий циклична, так как по существу метаболом регулирует геном посредством специальных белково-метаболических взаимодействий, которые прямо или косвенно контролируют генную транскрипцию. В биосистемах существует много примеров генов, регулируемых промежуточными или конечными продуктами метаболизма посредством обратной связи. Наверно, самыми изученными и описанными регуляторными системами в организме млекопитающих являются метаболизм холестерина и метаболизм глюкозы. Оксид азота и кислород, являющиеся продуктами метаболических превращений, также участвуют в регуляции транскрипции генов. Окружающая среда, лекарства и пищевые продукты, которые могут содержать ксенобиотики и токсичные вещества, взаимодействующие с ДНК, мРНК и белками, определяют конечную метаболическую структуру биологических систем, тогда как геном и протеом определяют лишь возможную структуру метаболома.

Определение терминов «метаболомика» и других «-омиков» не являются строгими в научном смысле. Слово «метаболомик» впервые было опубликовано в книге «Effect of Slow Growth on Metabolism of Escherichia coli, as Revealed by Global Metabolite Pool (metabolom) Analysis» в 1998 г. Метаболом описывает совокупность метаболических процессов в каждой клетке, ткани, организме или биологической жидкости; следовательно, метаболомика является системой технологий, направленных на объяснение и изучение метаболомов. Подобно геномам и протеомам, существуют различные метаболомы, содержащиеся как в клетках одноклеточных организмов, так и клетках тканей многоклеточных организмов. Также существуют метаболомы и в биологических жидкостях — моче, спинномозговой жидкости и плазме. В биологических жидкостях человека и животных можно обнаружить различные метаболиты при нормальных метаболических процессах и при воздействии ксенобиотиков на организм.

Начиная с 2002 г., активно развивается метабономика — новая технология количественного измерения динамического мультипараметрического метаболического ответа живых систем при патофизиологических или генетических изменениях (52). Изучение динамического и зависимого от времени профиля метаболитов in vivo уже сегодня приносит полезную информацию. Токсические эффекты, генетические и соматические заболевания могут проявляться нарушением синтеза некоторых белков. Однако, в конечном счете, происходит изменение управления биохимическими процессами, что отражается на соотношении концентраций многих эндогенных веществ в потоках биологических жидкостей (6, 11-13, 35, 38, 39. 43, 48-54, 60, 69, 71, 75, 78). Нарушение динамического равновесия в биологических жидкостях организма, вызванное заболеванием или интоксикацией, изменяет их качественный и (или) количественный состав. Для установления факта происходящих изменений необходимо одновременно определить множество метаболитов в широком диапазоне концентраций в плазме крови, моче или желчи. При этом используют образцы как после типовой пробоподготовки, так и без предварительного выделения.

В токсикологическом определении метабономика — это изучение множественных метаболических изменений в биологических жидкостях, клетках и тканях при патологии или генетических модификациях. Основными инструментами новых технологий являются ядерно-магнитный резонанс (ЯМР), масс-спектрометрия (МС, MS), новейшие тандемные инструментальные методы (81, 82).

В протеомике часто применяют различные варианты масс-спектрометрии, используя лазерную десорбционную ионизацию (MALDI) или электроспрейную ионизацию (ESI). Полученные результаты отвечают на вопрос: чем различаются белки больной и нормальной клеток? Самым популярным методом в настоящее время является двухмерный гель-элекрофорез. Клеточные белки сначала изолируют из клеток или тканей преимущественно биохимическими и (или) хроматографическими методами. Клеточные белки разделяются на матрице геля акриламида по pH-градиенту, что позволяет каждый белок в изоэлектрической точке сконцентрировать на геле. Начальное разделение на геле (по зарядам) сопровождается повторным разделением (перпендикулярно к первому) на том же самом геле относительно молекулярной массы. Используя автоматизированные системы SPOTS или альтернативную технологию, элюируют определяемый белок. Изолированные белки расщепляются трипсином для получения фрагментов пептидов, состоящих из 10-20 остатков аминокислот. Масса полученных пептидов может быть точно определена масс-спектрометрией. Тандемная масс-спектрометрия (MS - MS, MS2) позволяет фрагментарно определять аминокислотный состав пептида в небольшой области копии геномной последовательности без использования полной длины. Фрагменты слишком мало различаются по массе, чтобы их можно было определить с помощью обычной MS. Двухмерный электрофорез обладает низкой воспроизводимостью, трудностью автоматизации и другими существенными ограничениями.

В 2000 г. был представлен новый подход, использующий жидкостную хроматографию, и новое поколение масс-спектрометров. Сложные смеси подвергаются протеолизу трипсином (то есть ферментативному расщеплению); пептиды, разделенные с помощью жидкостной хроматографии, подаются в масс-спектрометр (ВЭЖХ-МС). Для обнаружения пептидов и белков предпочитают применять MS, благодаря ее чувствительности и возможности автоматизации компьютерных алгоритмов, способных использовать данные MS для идентификации закодированного геном пептида (78).

Применение ЯМР в метаболических исследованиях может иметь два подхода. Первый подход может быть объединен под общим названием «метаболомика» — обнаружение и идентификация всех эндогенных соединений и метаболитов ксенобиотиков (44, 70). Второй — обнаружение и идентификация в биологических жидкостях эндогенных соединений и метаболитов ксенобиотиков, характеризующих конкретное патологическое состояние организма, построение моделей различных патологических состояний. Второй подход разработан Д. Николсоном с соавторами и назван «метабономика» (41, 48-52). Видимое различие между метаболомикой и метабономикой состоит в том, что, как уже сказано, метаболомика — это изучение метаболизма в клетке и ткани,  а  метабономика — подход к изучению метаболизма при использовании биологических жидкостей как индикаторов происходящих (патологических) процессов. При токсикологическом исследовании используются оба подхода. В конечном счете, эти два подхода должны отвечать на ключевой вопрос токсикологии: какой биохимический вред нанесен клетке и как это связано с определенным патологическим состоянием?

«Метаболическое профилирование» и «биохимическое профилирование» — также широко используемые термины для описания метаболических исследований. Метаболическое профилирование является способом определения качества и (или) количества небольших молекул в биологическом объекте. Анализ может включать один или несколько технологических приемов: таких, как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), газовая хроматография (ГХ), капиллярный электрофорез(КЭФ), МС и ЯМР (81, 82). Исторически профилирование эндогенных метаболитов сводилось к определению специфических соединений или типов соединений. Например, после приема красного вина органические кислоты, находящиеся в моче, или флавоноиды в крови могут быть обнаружены несколькими методами — ГХ-МС, ВЭЖХ-МС или ЯМР. Таким образом, получался «снимок» уровня метаболитов в определенное время и в определенном состоянии. В настоящее время метаболическое профилирование может быть рассмотрено уже в составе (системе) метаболома. Современные аналитические технологии нацелены на качественное и количественное определение всех эндогенных метаболитов в различных типах клеток, тканей и биологических жидкостей. Пока это трудновыполнимо, но ученые ищут пути подобного определения. Проблема заключается в разработке единых (стандартных) аналитических методик определения и регистрации результатов при исследовании биологических объектов.

В течение многих лет определение особенностей метаболизма с помощью скрининга биологических жидкостей было основным методом обнаружения врожденных аномалий метаболизма. Токсикологам необходимо количественное определение специфических метаболитов или классов метаболитов. В настоящее время для обнаружения метаболических маркеров токсичных веществ или лекарственных средств используются самые современные аналитические методы. Для определения большого количества метаболитов стали использовать МС и ЯМР, их разновидности, комбинированные методы (например ВЭЖХ-МС-ЯМР). Данные, полученные в ходе этих исследований для воссоздания реально происходящих процессов in vivo, опираются на установление полной структуры определяемых веществ.

Результаты анализов позволяют классифицировать проявление различных типов токсичности или аномалий в организме. В литературе, посвященной ЯМР-исследованиям, часто используют графические способы представления данных. Получают спектральные картинки, отнесенные к тому или иному метаболому (условно их можно сравнить с характерными паттернами на биочипах). При этом проявляются явные противоречия, касающиеся информации о биомаркерах — метаболитах токсикантов в моче, полученной ранее традиционными методами. Во всяком случае, новейшие тандемные инструментальные методы, например ВЭЖХ-ЯМР, при разделении и определении метаболитов в биологических жидкостях, имеют большие возможности для понимания токсического действия лекарственных средств и других химических веществ. Во многих токсикологических исследованиях в результате мониторинга процессов, происходящих в организме в ответ на действие лекарств, отмечается, что изменения в метаболизме предшествуют гистологическим изменениям. Очевидно, возможность определения однозначных индивидуальных ответных реакций до получения достоверно фиксированных токсикологических или гистологических реакций принесет несомненную пользу пациентам.

В настоящее время метаболомические исследования применяются и для разработки новых лекарств. Доказательством этому является создание в США, Японии и странах Евросоюза небольших компаний по выполнению различных метаболомических анализов для более крупных фармацевтических организаций. Одна из задач этих компаний заключается в быстром получении ранних метаболических маркеров токсичности (или безопасности) лекарств, что может использоваться для оценки качества и безопасности лекарственных средств для животных и людей. Другая задача заключается в открытии новых метаболических маркеров, образующихся в организме человека в ответ на действие лекарств, которые в дальнейшем смогут использоваться для выявления людей, «нестандартно» реагирующих на то или иное вещество. По сути, метаболомика ускоряет процесс создания лекарств и значительно увеличивает шансы на безопасное и эффективное их применение. Метаболомика и метабономика позволяют отличить «нормальный» метаболизм от «измененного».

Продолжение следует.

Последнее обновление ( 07.04.2009 г. )
 
« Пред.   След. »


Copyright 2012 Bioinformatix.ru