Лекция «Исследование качественных и количественных характеристик транскриптома».  Данная лекция состоит из трех частей с пояснительным текстом для каждой части.

Первая лекция посвящена определению термина «транскриптом», выявлению места транскриптома среди других предметов исследования науки о функциональной организации генома, а также обзору современных методов получения качественных и количественных данных о нем.

Вторая лекция посвящена краткому обобщению выводов по сопоставлению характеристик методов, изложенных в прошлой лекции и обзору примеров приложения высокопродуктивных и компьютероемких методов получения качественных и количественных данных о транскриптоме – SAGE и EST.

Третья лекция - конкретные примеры применения метода ДНК-биочипов в биологии. Самые распространенные области их применения – это анализ полиморфизма, анализ экспрессии генов и сравнительный анализ геномов.

Введение

Транскриптом – Особенность транскриптома в том, что, поскольку он является первым уровнем фенотипа, т.е. первым уровнем развертывания и реализации генетической информации, заключенной в геноме.

Его структура  сложно организована, поскольку отражает зависимость от стадий клеточного цикла, от типа клеток и тканей, от стадий развития организма, от наличия внешних сигналов как самой транскрипции генов, так и различных пост-транскрипционных процессов – сплайсинга, редактирования, взаимодействия с микроРНК и короткими интерферирующими РНК.

Иными словами, транскриптому изначально присуща пространственная и временнáя дифференциальность в распределении транскриптов разных генов и изоформ транскриптов отдельного гена.

Исследование транскриптома – одна из задач функциональной геномики. Напомню эти задачи, которых несколько в соответствии с тем набором функций, который выполняет геном.

Функции генома:
– содержать/кодировать генетическую информацию и генетические программы развития,
– сохранять их в процессах жизнедеятельности одной особи - (1) в течение одного клеточного цикла - репликация, репарация, генная конверсия, борьба с транспозабельными элементами и т.д., (2) в процессе пролиферации клеток -  передача через ряд митотических делений – компактизация и декомпактизация хромосом, митоз и т.д.,
– передавать их в ряду поколений – процессы мейоза, сегрегации хромосом, рекомбинации/кроссинговера, поддержания целостности теломер и т.д.,
– создавать/поддерживать условия для формирования транскриптома, т.е. набора транскриптов, характерного для клеток разных типов и предопределенного генетическими программами развития - процессы (1) транскрипции (сайленсеры, энхансеры, граничные элементы/инсуляторы, организация промоторов для конститутивной или индуцибельной экспрессии, сигналы завершения синтеза транскрипта РНК-полимеразой и т.д.) и (2) сплайсинга (сигналы сплайсинга, регуляция альтернативного сплайсинга).

Таким образом, мы видим, что исследование транскриптома является одной из задач функциональной геномики в той мере, в какой информация, необходимая для формирования его структуры, закодирована в геноме и может быть выявлена при его изучении.

Еще раз коротко определим наш объект: Транскриптом – совокупность всех транскриптов всех генов, экспрессирующихся в какой-либо клетке, или группе однотипных клеток – т.е. ткани, или во всех клетках организма в определенные моменты функционирования и/или развития.

В соответствии с функциями самого транскриптома есть несколько задач транскриптомики - науки, изучающей транскриптом:
–    исследование структуры транскриптов и изоформ транскриптов, образованных в процессах альтернативной транскрипции и альтернативного сплайсинга, транс-сплайсинга, РНК-редактирования и т.д.,
–    исследование дифференциального временнóго и пространственного распределения транскриптов в клетках и организмах, сформированного в результате процессов их транскрипции, их транспорта из  ядра,  их транспорта и запасания в цитоплазме, их miRNA- опосредованной деградации и деградации, связанной с их трансляцией.

Применение методов биоинформатики на уровне транскриптома для исследования структуры транскриптов и их дифференциального временнóго и пространственного распределения в клетках и организмах позволяет:

–  реконструировать коды, заключенные в геноме (кооперация с геномикой)
– выявлять информацию в виде сигналов и кодов, необходимую для формирования протеома (кооперация с протеомикой).

Применение методов биоинформатики к транскриптомным экспериментальным данным выдвигает ряд требований к  этим данным и методам получения их.

Требования к методам исследования структуры транскриптов и их дифференциального временнóго и пространственного распределения в клетках и организмах:

– возможность  измерения относительного и абсолютного содержания транскриптов определенного гена в клетках разных типов;
– возможность  одновременного измерения соотношения транскриптов как можно большого количества генов;
– возможность детекции транскриптов очень слабо или очень специализированно экспрессирующихся генов (достаточно широкий динамический диапазон);
– высокая производительность и эффективность для производства достаточно большого массива данных.

Рассмотрим сначала методы исследования отдельных элементов транскриптома – транскриптов, а именно качественные и полуколичественные методы исследования структуры транскриптов и их дифференциального временного и пространственного распределения.

Обзор методов исследования структуры и распределения транскриптов начнем с методов прямой детекция молекул РНК.

Метод Нозерн-блот-гибридизация является одним из самых первых, разработанных для этих целей, но он до сих пор не потерял своей актуальности и очень часто применяется. Название его не имеет никакого отношения к «северу», оно было придумано в шутку по аналогии с названием метода «Саузерн-блот-гибридизация», предложенного исследователем  Саузерном, и затем прижилось